2,2′-聯咪唑硝基衍生物的合成及與DNA相互作用的研究

楊莉寧，姚 琳，余麗麗，楊黎燕，尤 靜

(西安醫學院藥學院， 陜西 西安 710021)

咪唑是一種廣泛用于生物和醫藥領域的化學藥劑，硝基咪唑類藥物除了具有顯著的抗菌活性外[1]，還具有抗病毒[2,3]、抗結核[4,5]、抗寄生蟲[6～8]、抗腫瘤[9]等作用，目前已有眾多該類藥物應用于臨床。鑒于硝基咪唑類藥物在抗微生物方面的突出效果，作者合成了2,2′-聯咪唑(H2biim)的單硝基衍生物NO2Hbiim和二硝基衍生物(NO2)2biim，對其進行了表征，并采用紫外光譜法、熒光光譜法及粘度法初步研究了其與小牛胸腺DNA之間的相互作用方式，探討了化合物結構與DNA相互作用之間的構效關系。這些工作對于闡明小分子藥物對核酸的復制和轉錄的影響、DNA靶標藥物與DNA的相互作用機制具有一定的意義，為藥物的定向合成提供了理論基礎。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

N,N-二甲基甲酰胺、冰醋酸、醋酐、醋酸銨、發煙硝酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris，阿拉丁試劑公司)，分析純；乙二醛水溶液，化學純；小牛胸腺DNA(ct-DNA)，生化試劑， Sigma公司。所有試劑用前未作進一步處理；實驗用水為二次蒸餾水。

Vario EL-ⅢG型元素分析儀，德國EA 元素分析系統公司；EQUINOX55 型紅外光譜儀，德國 Bruker 公司；JA2003型電子天平，上海越平科學儀器有限公司；STA449C型熱分析儀，德國Netzch公司；1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；Ubbeoldhe型粘度計，上海申玻玻璃儀器廠；F-4500型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.2 2,2′-聯咪唑硝基衍生物的合成路線[10]及表征

2,2′-聯咪唑硝基衍生物的合成路線如下：

采用元素分析儀和紫外可見分光光度計測定化合物的元素分析值和紫外可見吸收波長。

以KBr壓片，在400～4000 cm-1范圍內測定H2biim、NO2Hbiim、(NO2)2biim的紅外光譜。

采用熱分析儀進行熱重分析，氮氣氣氛，流速30 cm3·min-1，升溫速率為20 ℃·min-1。

1.3 化合物與DNA相互作用實驗

實驗所需試劑、緩沖溶液的配制以及與DNA相互作用研究均參照文獻[11,12]的經典方法。考察DNA濃度對化合物紫外吸收光譜和熒光光譜的影響及化合物濃度對DNA粘度的影響。

2 結果與討論

2.1 2,2′-聯咪唑硝基衍生物的表征

2.1.1 元素分析和紫外吸收光譜分析(表1)

表1 化合物的元素分析及最大紫外吸收波長

由表1可知，元素分析的實測值與理論值比較接近，基本可以確定4-硝基-2,2′-聯咪唑、4,4′-二硝基-2,2′-聯咪唑的組成。二者的最大紫外吸收峰分別位于271 nm和269 nm，歸因于其結構中聯咪唑大環共軛體系的π-π*躍遷。與H2biim的紫外吸收峰相比，由于取代基硝基的作用導致NO2Hbiim和(NO2)2biim生色基的吸收峰向短波方向移動，因而發生了紫移。

2.1.2 紅外光譜分析(表2)

表2 化合物的IR圖譜數據/cm-1

2.1.3 熱重分析(圖1)

圖1 NO2Hbiim和(NO2)2biim的熱重曲線

由圖1可知，兩種硝基衍生物熱分解趨勢類似，明顯分為兩步。二者的TG曲線分別在350 ℃和400 ℃之前幾乎是一平臺，對應的DSC曲線顯示在這兩個溫度附近都有吸熱峰，歸結于兩種硝基化合物的熔化和分解吸熱，說明NO2Hbiim和(NO2)2biim的熔點分別在350 ℃和400 ℃左右。隨后樣品開始失重，TG曲線快速坍塌下滑，隨著化合物的分解，NO2Hbiim在接近380 ℃、(NO2)2biim在接近420 ℃時TG曲線下滑趨緩，失去了化合物中的不穩定基團后剩下的殘余物平緩分解直至完全。可以看出，(NO2)2biim比NO2Hbiim熔點高，熱穩定性更好。

2.2 2,2′-聯咪唑硝基衍生物與DNA相互作用的研究

2.2.1 與DNA相互作用的紫外吸收光譜分析

圖2為NO2Hbiim、(NO2)2biim與DNA相互作用的紫外吸收光譜。

由圖2可知，隨著DNA濃度的增大，NO2Hbiim的兩個最大紫外吸收峰出現減色效應，且其中一個特征吸收峰明顯紅移，由原來的343 nm紅移到了353 nm；而(NO2)2biim則呈現增色效應，吸收峰也發生很大程度的紅移，由原來的340 nm紅移到了380 nm。一般情況下，如果紫外吸收峰強度降低，波長紅移，可認為有小分子插入DNA分子中。因為DNA堿基對與含螯合芳香環的小分子發生π電子堆積，堿基的π電子軌道與小分上的π*空軌道發生偶合，能級下降，π-π*躍遷能量減小，發生紅移現象；而且偶合后的π*軌道部分填充電子，π-π*躍遷幾率變小，也會發生減色效應[13]。但某些化合物的吸收光譜因DNA的加入會出現增色效應，這可能是因為這些化合物與DNA結合時，溶液中化合物分子之間氫鍵及化合物聚集體被破壞[14～16]。據此推測， NO2Hbiim是以經典的插入方式與DNA作用，而(NO2)2biim可能是以非插入方式與DNA作用。

1～6，cDNA(×10-6mol·L-1)：0，0.6703，1.330，1.984，2.629，3.265

2.2.2 與DNA相互作用的熒光光譜分析

圖3為NO2Hbiim及(NO2)2biim與DNA相互作用的熒光光譜。

1～6，cDNA(×10-6mol·L-1)：0，0.6703，1.330，1.984，2.629，3.265

由圖3可知，NO2Hbiim、(NO2)2biim與DNA作用后其熒光強度隨著DNA濃度的增大逐漸增強且增幅較大，二者的最大熒光吸收峰的位置分別在515 nm、475 nm左右。它們與DNA之間可能發生了插入作用。因為化合物小分子若嵌入DNA雙螺旋堿基對之間，從溶液的親水環境進入DNA內腔的疏水環境，避免了溶劑分子的猝滅，即發生強烈的熒光敏化現象。根據增色程度大小判斷，NO2Hbiim與DNA的作用更強。NO2Hbiim分子和(NO2)2biim分子都含有聯咪唑環，但NO2Hbiim比(NO2)2biim分子少一個硝基，空間位阻更小，共平面性更好，因而插入DNA雙螺旋的堿基對之間更容易，作用力更強。

2.2.3 與DNA相互作用的粘度分析

粘度法是在缺乏晶體結構時，確認小分子化合物與DNA結合方式最有權威的證據之一[17]。當小分子化合物插入DNA時，使DNA螺旋鏈增長，DNA粘度相應增大[18]；當與DNA以非插入方式作用時，不會導致DNA結構伸展，DNA粘度基本不變。圖4為化合物濃度對DNA溶液相對比粘度的影響曲線。

由圖4可知，隨著NO2Hbiim濃度的增大，DNA的粘度呈增大趨勢；而(NO2)2biim濃度的增大對DNA的粘度基本沒有影響。由此判斷，NO2Hbiim以插入方式與DNA作用，(NO2)2biim以非插入方式與DNA作用，與光譜法研究結果一致。

圖4 NO2Hbiim和(NO2)2biim濃度對DNA溶液相對比粘度的影響

3 結論

合成了2,2′-聯咪唑的單硝基NO2Hbiim和二硝基衍生物(NO2)2biim。研究表明，NO2Hbiim是以經典的插入方式與DNA相互作用，而(NO2)2biim是以非插入方式與DNA作用；化合物的結構對其與DNA的相互作用有很大的影響；NO2Hbiim比(NO2)2biim的取代基少，位阻效應弱，兩個咪唑環的共平面性更好，因而NO2Hbiim與DNA之間的作用強于(NO2)2biim。

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