復(fù)方松及片提取物對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響

危金松 李金優(yōu) 梅汝煥 曾豆豆 李子剛 陳季強 湯慧芳

1.湖北省京山縣中醫(yī)院，湖北 京山 431800；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 浙江省呼吸藥物研究實驗室，浙江 杭州 310058；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310000

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種原因不明、與年齡相關(guān)的破壞性肺部疾病，以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征，通常這種實質(zhì)病變具有不可逆性及嚴(yán)重的致死率[1]。目前尚無有效的治療手段來阻止或逆轉(zhuǎn)纖維化的過程，因此尋找可以在上皮損傷過度修復(fù)過程中發(fā)揮作用的藥物，成為探索終止和逆轉(zhuǎn)肺纖維化過程的關(guān)鍵。

復(fù)方松芨片（Compound Formula Rosin and Bletilla Table，CFRB）的主要成分是白及（Bletillae Rhizoma）、沙參（Fourleaf Ladybell Root，Radix Adenophorae）、百部（Stemona Root，Radix Stemonae）等，這些成分均歸肺經(jīng)，具清肺、化痰、止咳、扶正抗癆、止血生肌等功能，臨床上主要用于各型結(jié)核病出血、慢性咳喘及慢性胃腸疾病等，臨床效果顯著。有文獻(xiàn)報道白及對矽肺肺部癥狀有改善作用[2]，而沙參對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化有改善作用[3-5]，但作用尚不清楚。本研究采用博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型，研究CFRB對肺纖維化病理改變的影響，進(jìn)一步檢測代表性的炎癥因子如TGF-β1的分泌，肺組織中羥脯氨酸的含量等，并從mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)機制研究，為臨床治療肺纖維化提供新途徑，為老藥新用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、試劑和儀器

ICR小鼠，雄性，8周，體重在20～22 g，由浙江大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：2007000526749。動物飼養(yǎng)及操作過程均遵守浙江大學(xué)《實驗動物管理條例》要求。

博萊霉素（Sigma 公司，批號：9041-93-4），復(fù)方松及片（京山中醫(yī)院，批號：20100501），地塞米松磷酸鈉注射液（浙江省仙琚制藥股份公司）。

Real time PCR 相關(guān)試劑[包括 dNTP Mixture，Oligo（dt）18 primer，RNase Inhibitor，M-MLV Reverse Transcriptase，寶生物工程（大連）有限公司]，羥脯氨酸測定試劑盒（凱基，KGT030-2），小鼠TGF-β1 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），小鼠β-actin、PDE8A引物（由上海生工生物工程有限公司合成）。

PCR儀（Eppendoff公司），水平電泳儀（英國CLP公司）。

1.2 模型建立與實驗分組

根據(jù)本實驗室建立的小鼠肺纖維化造模方法，對小鼠進(jìn)行4%水合氯醛麻醉（280 mg/kg），然后有創(chuàng)氣道給藥法滴入生理鹽水配制的博萊霉素（2.5 g/L），劑量為2.5 mg/kg，地塞米松組腹腔注射地塞米松2.0 mg/kg，正常組滴入同等體積的生理鹽水。

CFRB提取液配制方法：將片劑粉碎研磨后稱重，5倍重量的蒸餾水浸泡過夜，5000 g離心取上清，然后70℃水浴濃縮至1 g/mL濃度，依次稀釋成0.20、0.04 g/mL。灌胃給藥劑量分別為低劑量0.4 g/kg、中劑量2.0 g/kg、高劑量10.0 g/kg，博萊霉素氣道滴入后即開始給藥，博萊霉素給藥后14 d處理，半側(cè)肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗及留取另半側(cè)肺組織進(jìn)行病理學(xué)、蛋白及分子生物學(xué)檢測等。

1.3 肺組織病理學(xué)觀察

小鼠股動脈放血處死后，留取肺組織用10%福爾馬林溶液固定，制備石蠟切片，作病理檢查，進(jìn)行Masson染色，觀察肺組織纖維化改變，Masson染色組織切片上藍(lán)染色的為膠原蛋白。

1.4 肺組織中羥脯氨酸含量測定

取右肺稱重，加入1 mL水解液勻漿后100℃水浴（電磁爐保溫檔）水解20 min，調(diào)pH值至6.0～6.8，然后加入蒸餾水10 mL，混勻，3500 r/min 離心 10 min，取 1 mL 上清，60℃水浴15 min，冷卻后，550 nm波長讀取數(shù)值。計算公式：

羥脯氨酸含量（μg/mL）=（測定管吸光度-對照管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)管含量（μg/mL）×[水解總體積（mL）/取樣量（mL）]

1.5 BALF 中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的 ELISA測定

取1 mL生理鹽水灌洗肺組織得到肺泡灌洗液。以2000 r/min離心10 min，留取上清液。按照說明書進(jìn)行TGF-β1的ELISA含量測定。

1.6 Real time-PCR測定肺組織中磷酸二酯酶8A的mRNA的表達(dá)

取液氮固定的左肺組織加入1 mL Trizol于冰浴中勻漿，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃保存。以cDNA為模板，用目的基因PDE8引物進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，內(nèi)參為βactin。引物序列如下： 小鼠 β-actin上游 （5'-3'）：GAT TAC TGC TCT GGC TCC TAG C；小鼠 β-actin 下游（5'-3'）：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG C。擴(kuò)增條件為：95℃ 10 s，60℃30 s，72℃ 45 s，25 個循環(huán)。 小鼠 PDE8A 上游 （5'-3'）：CCA TCA CCA AGG TAA TCA； 小鼠 PDE8A 下游 （5'-3'）：TCC GTG GTG GGA CAT CAT。 擴(kuò)增條件為：95℃ 10 s，48.9℃ 30 s，72℃ 45 s，40 個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFRB提取物對博萊霉素誘導(dǎo)肺組織纖維化的病理變化的影響

博萊霉素氣道滴入后14 d，成功誘導(dǎo)了肺組織纖維化病變。Masson染色呈藍(lán)色的即沉積的膠原纖維。模型組氣道附近膠原沉積明顯，肺泡組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，間隔消失形成空洞。正常組的肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰且完整，無炎癥細(xì)胞浸潤。而地塞米松組對抗博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化病變作用不明顯。CFRB提取物對此纖維化病變的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性，低劑量組效果不明顯，高劑量對此纖維化有明顯抑制作用。見圖1。

圖1 CFRB提取物對博萊霉素致肺纖維化的影響（×10）

2.2 CFRB提取物對博萊霉素誘導(dǎo)纖維化肺組織羥脯氨酸含量的影響

肺組織中羥脯氨酸含量在博萊霉素氣道滴入后14 d即快速上升，與正常組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。地塞米松組羥脯氨酸含量有抑制趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低、中劑量CFRB提取物對羥脯氨酸的影響也不明顯，但高劑量組下降較明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 CFRB提取物對肺組織勻漿中羥脯氨酸含量的影響

2.3 CFRB提取物對博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠BALF中TGF-β1含量的影響

在博萊霉素刺激后14 d，TGF-β1上升迅速，達(dá)325 pg/mL，明顯高于正常對照組（P<0.001）。而CFRB提取物各劑量對TGF-β1的分泌較均模型組有明顯抑制作用，尤以高劑量組為顯著 （P<0.001）。而地塞米松組較模型組也能明顯抑制TGF-β1 的分泌（P<0.001）。

圖3 CFRB提取物對BALF中TGF-β1水平的影響

2.4 CFRB提取物對博萊霉素誘導(dǎo)纖維化肺組織中PDE8A mRNA表達(dá)的影響

根據(jù)定量PCR結(jié)果，博萊霉素刺激后肺組織中PDE8A的mRNA表達(dá)量明顯增加，這與肺纖維化的趨勢相符。與正常組比較，14 d的PDE8A mRNA表達(dá)差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），相對表達(dá)量比值為0.49；CFRB提取物各劑量組PDE8A mRNA的相對表達(dá)量與模型組比較均有明顯下降（P<0.05或P<0.01）。地塞米松組PDE8A的表達(dá)也有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 博萊霉素誘導(dǎo)PDE8A mRNA的變化

3 討論

復(fù)方松及片里的成分較多，主要成分白及，具有止血生肌、化痰斂肺的作用。臨床多用于大咯血、肺結(jié)核少量咯血等的治療，效果較顯著[6-7]。白及水提物中的主成分為白及多糖[8-9]，有研究表明其具有抗菌[10]、抗氧化[11]、抑制大鼠皮膚成纖維細(xì)胞VEGF的mRNA表達(dá)[12]等作用。中藥治療矽肺的記載中提及白及對矽肺癥狀有治療作用，但對X光胸片無改善[2]。沙參具有祛痰作用，有研究報道其對博萊霉素誘導(dǎo)的實驗性肺纖維化有明顯改善作用[3]，能降低肺組織纖維連接素、層粘蛋白的含量[4]。對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠也有明顯改善作用，能降低肺組織羥脯氨酸含量[5]。百部生物堿具有止咳、化痰、平喘、抗菌等作用[13]。Liao等[14]研究發(fā)現(xiàn)百部水提取物對Carbacol、組織胺、Kcl所致的離體豚鼠支氣管平滑肌痙攣有松弛作用。

磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）是細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的水解酶，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞內(nèi)第二信使?jié)舛绕胶猓谛盘杺鬟f過程中扮演著重要作用。PDEs作為一個有11個家族成員的蛋白酶超家族，擁有非常多的變異體。最近的研究表明PDE8家族是保持cAMP穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)者之一，在淋巴細(xì)胞中高表達(dá)，提示其在調(diào)節(jié)免疫和炎癥中起作用，但目前對其抗炎作用的研究尚無。目前已知哺乳動物PDE8家族包括2個基因PDE8A、PDE8B。兩種異構(gòu)體都對cAMP有特異性且對底物有著很高的親和力。PDE8A mRNA的表達(dá)十分廣泛并在許多組織被檢測到，PDE8已被證實與淋巴細(xì)胞趨化相關(guān)，通過干預(yù)淋巴細(xì)胞內(nèi)cAMP信號通路可以阻止淋巴細(xì)胞透過毛細(xì)血管向炎癥病灶區(qū)聚集。抑制劑實驗證明抑制PDE8可以彌補單獨抑制PDE4的不足，阻止炎癥病灶區(qū)對淋巴細(xì)胞的募集作用[15]。

博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化與IPF的病理生理相似，是目前應(yīng)用最廣泛的肺纖維化模型，用藥后14～28 d形成肺纖維化[16]。最近有研究報道PDE亞型抑制劑如PDE4抑制劑-羅氟司特和西洛司特、PDE5抑制劑-西地那非等均對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型有作用[17-19]。而PDE8目前功能尚不清楚。筆者研究發(fā)現(xiàn)，博萊霉素刺激14 d肺泡炎癥細(xì)胞浸潤，大量巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞聚集并釋放到肺泡腔，膠原沉積于肺泡間質(zhì)，表明本實驗肺纖維化模型制備成功。在這個過程中大量的信號因子被釋放出來，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的遷移與增殖如TGF-β1。TGF-β1是主要導(dǎo)致纖維化的細(xì)胞因子，可直接作用于成纖維細(xì)胞，主要由巨噬細(xì)胞分泌[20]。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)PDE8A在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型上表達(dá)上調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)了CFRB的粗提物對其有效，檢測代表性的炎癥因子如TGF-β1等的分泌及羥脯氨酸含量等指標(biāo)，結(jié)果均提示CFRB能有效對抗博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化改變。筆者將上述結(jié)果中的TGF-β1含量與PDE8A mRNA表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果顯示TGF-β1含量的變化趨勢與PDE8A mRNA表達(dá)量間的相關(guān)系數(shù)為0.541（P<0.05）。提示PDE8A與肺纖維化間存在相關(guān)性，提示PDE8A可能是CFRB的作用靶點，也提示PDE8A可能是肺纖維化的治療靶點。

綜上所述，CFRB提取物能有效對抗肺纖維化病變，其機制涉及PDE8A亞型在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠纖維化肺組織中高表達(dá)，提示CFRB可能成為肺纖維化治療藥物，同時PDE8A可能是一個較好的抗肺纖維化藥物的研究靶點。

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