重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)對(duì)比劑誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

王文杰 戴 春 呂昌云

1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇 徐州 221002；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 徐州 221002；3.總參軍訓(xùn)和兵種部徐州干休所，江蘇 徐州 221002

隨著放射診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和介入治療的廣泛應(yīng)用，對(duì)比劑腎病（contrast-induced nephrology，CIN）開(kāi)始引起了人們的關(guān)注。研究表明，在4622例住院患者中，腎功能不全發(fā)生率為7.2%，其中CIN是僅次于腎灌注不足和腎毒性藥物引起腎衰竭的第三大常見(jiàn)原因[1-2]。因此研究如何有效地預(yù)防或減少造影劑的腎毒性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

臨床上用于改善貧血狀態(tài)的重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）具有抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、血管修復(fù)、抗纖維化及促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生等作用[3-8]。但rhEPO是否對(duì)對(duì)比劑腎損害有保護(hù)作用，目前國(guó)內(nèi)尚缺乏充分的研究及報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)不同劑量rhEPO的研究，探討其對(duì)大鼠CIN的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠40只，體重180～240 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 rhEPO（益比奧，沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司），吲哚美辛（美國(guó)Sigma公司），N-硝基-L-精氨酸甲酯（美國(guó)Sigma公司），泛影葡胺（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CIN動(dòng)物模型建立 大鼠禁食、水12 h，水合氯醛腹腔麻醉后，分離左股靜脈埋入留置針，依次注射預(yù)先配置的吲哚美辛10 mg/kg，15 min后注射左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）10 mg/kg；15 min 后注射泛影葡胺 10 mL/kg[9]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 將所有大鼠編號(hào)，隨機(jī)分成5組，每組8只，全部大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。①空白對(duì)照組：造模前3天腹腔注射生理鹽水1.5 mL/d，造模當(dāng)天股靜脈每隔15分鐘注射生理鹽水1.5 mL，共3次。②實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：造模前3天腹腔注射生理鹽水1.5 mL/d，造模當(dāng)天每隔15 min分別注射吲哚美辛10 mg/kg、N-硝基-L-精氨酸甲酯 10 mg/kg、生理鹽水 1.5 mL。 ③模型組：造模前3天腹腔注射生理鹽水1.5 mL/d，造模當(dāng)天每隔15分鐘分別注射吲哚美辛10 mg/kg、N-硝基-L-精氨酸甲酯10 mg/kg、泛影葡胺10 mL/kg。④rhEPO 1組：造模前3天腹腔注射rhEPO 3000 IU/（kg·d），造模當(dāng)天同模型組。⑤rhEPO 2組： 造模前 3天腹腔注射 rhEPO 600 IU/（kg·d），造模當(dāng)天同模型組。每組大鼠分別于造模前、造模后48、72 h時(shí)內(nèi)眥取血測(cè)血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），造模后 72 h處死大鼠后迅速取腎，去除腎包膜，于10%甲醛緩沖溶液內(nèi)固定備作腎組織病理檢查（以上均在冰臺(tái)上操作）。

1.3 腎臟病理及腎小管評(píng)分

切片常規(guī)脫蠟，HE染色，光鏡觀察。腎小管評(píng)分采用Paller法[10]評(píng)分，即根據(jù)腎小管擴(kuò)張程度、腎小管萎縮程度、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性程度、腎小管上皮細(xì)胞壞死程度、間質(zhì)纖維化程度及腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度的無(wú)、輕、中、重分別計(jì)0、1、2、3分。每張切片連續(xù)觀察10個(gè)不重疊的高倍視野，并計(jì)算平均得分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能指標(biāo)變化

各組實(shí)驗(yàn)前 Scr、BUN無(wú)明顯差異（P>0.05）；空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組之間各時(shí)間點(diǎn)Scr、BUN無(wú)明顯差異 （P>0.05）；與空白對(duì)照組比較，模型組造影后48、72 h Scr較實(shí)驗(yàn)前上升>25%，提示造模成功。與空白對(duì)照組比較，模型組、rhEPO 1、2 組造影后 48、72 h Scr、BUN 均有明顯上升 （P<0.05）；與模型組比較，rhEPO1、2 組造影后48、72 h Scr、BUN均有明顯下降（P<0.05）。rhEPO 1 組（3000 IU/kg）明顯優(yōu)于小劑量 rhEPO 2 組（600 IU/kg）（P<0.05）。 見(jiàn)表 1、2。

表1 各組大鼠 Scr水平比較（，μmol/L，n=8）

表1 各組大鼠 Scr水平比較（，μmol/L，n=8）

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與rhEPO 1組比較，cP<0.05

2.2 HE染色檢測(cè)腎小管損傷程度

空白對(duì)照組可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞無(wú)明顯損傷，偶見(jiàn)單個(gè)腎小管上皮細(xì)胞脫落、再生現(xiàn)象，腎小管結(jié)構(gòu)正常（圖1）。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增生，毛細(xì)血管袢管腔無(wú)壓迫，腎小管上皮腫脹（圖2）。模型組可見(jiàn)大量腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、空泡變性、細(xì)胞脫落至小管腔，部分腎小管結(jié)構(gòu)破壞，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞腫脹、變性，系膜基質(zhì)輕度增多，腎間質(zhì)灶性水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3），較空白對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷評(píng)分顯著增加 （P<0.05），見(jiàn)表3。rhEPO 1組可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹，部分空泡變性，腎間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較模型組腎小管上皮細(xì)胞損傷明顯減輕 （圖4），rhEPO 2組可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)中度增生，毛細(xì)血管袢管腔無(wú)壓迫（圖5），較模型組腎小管上皮細(xì)胞損傷有所減輕，兩組與模型組腎小管損傷評(píng)分的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），rhEPO 1和2組之間腎小管上皮細(xì)胞損傷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠BUN水平比較（，mmol/L，n=8）

表2 各組大鼠BUN水平比較（，mmol/L，n=8）

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與rhEPO 1組比較，cP<0.05

表3 各組大鼠腎小管損傷評(píng)分比較（，分）

表3 各組大鼠腎小管損傷評(píng)分比較（，分）

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

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3 討論

近年來(lái)，盡管對(duì)比劑不斷改良：由離子型到非離子型，由高滲型到等滲型，但由于長(zhǎng)期以來(lái)依賴碘對(duì)比劑的診治項(xiàng)目不斷上升，CIN病例數(shù)還在不斷增長(zhǎng)。對(duì)比劑腎病是以使用對(duì)比劑后3 d內(nèi)，發(fā)生無(wú)其他原因可解釋的急性腎減退，通常以血清肌酐上升超過(guò)44 μmol/L或較基礎(chǔ)值上升 >25%作為診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。

對(duì)比劑腎病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，綜合現(xiàn)階段的研究成果，主要有腎缺血[12]、腎小管細(xì)胞毒性損傷[13]、氧自由基損傷[14]、腎小管阻塞[15]及細(xì)胞凋亡。另有學(xué)者提出對(duì)比劑作為一種過(guò)敏原，可能通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞而激活補(bǔ)體，引起全身過(guò)敏反應(yīng)以及腎臟的免疫反應(yīng)并最終導(dǎo)致CIN的發(fā)生[16-17]。目前有多個(gè)藥物用于預(yù)防CIN，其中，已被證實(shí)具有CIN預(yù)防作用的藥物包括茶堿、維生素C和前列腺E1等，而rhEPO對(duì)對(duì)比劑腎病的預(yù)防作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖1 空白對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)（HE，×400）

圖2 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)（HE，×400）

圖3 模型組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)（HE，×400）

圖4 rhEPO 1組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)（HE，×400）

圖5 rhEPO2組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)（HE，×400）

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，EPO不僅具有促進(jìn)機(jī)體生成紅細(xì)胞的作用，而且還具有多種非造血功能。Li等[17]發(fā)現(xiàn)EPO可以降低凋亡蛋白（Bad、Bax）活性，增加抗凋亡蛋白（Bcl-2，Bcl-xL）活性，誘導(dǎo)X染色體相關(guān)的凋亡蛋白抑制劑 （XIAP）表達(dá)，滅活caspases，保持線粒體膜電位，抑制細(xì)胞色素C釋放，發(fā)揮促細(xì)胞生存和抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)；Dang等[18]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)給予糖尿病大鼠EPO，可以顯著降低腎臟還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶的活性及其p47phox亞基的mRNA水平，發(fā)揮抗氧化作用。Shurtz等[19]報(bào)道EPO可抑制持續(xù)不臥床腹膜透析患者的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為減少外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，抑制中性粒細(xì)胞激活，減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生等；Ribatti等[20]發(fā)現(xiàn)，EPO能通過(guò)抑制缺氧引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，通過(guò)維持和重建血供，促血管生成進(jìn)而修復(fù)組織損傷。Lin等[8]的研究還發(fā)現(xiàn)，EPO能通過(guò)促進(jìn)骨髓內(nèi)Lin-/Sca-T+干細(xì)胞增生而促進(jìn)再灌注損傷后近端腎小管上皮細(xì)胞的再生。以上均表明EPO可能是腎小管損傷疾病潛在治療藥物。CIN既存在明顯的腎組織缺血缺氧、又有對(duì)比劑對(duì)腎小管細(xì)胞的直接毒性作用，EPO對(duì)這種對(duì)比劑腎病動(dòng)物模型是否具有保護(hù)作用，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)參考Agmon等[9]的方法，預(yù)先應(yīng)用吲哚美辛和硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）阻斷前列腺素和一氧化氮合酶，然后注射造影劑，成功建立了對(duì)比劑腎病大鼠模型。為排除吲哚美辛和L-NAME對(duì)大鼠腎功能是否有影響，筆者專門設(shè)置了實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組Scr、BUN水平及腎損傷評(píng)分均與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異（P>0.05），提示在本實(shí)驗(yàn)條件下吲哚美辛和L-NAME對(duì)大鼠腎功能未造成損傷。造模組造影后48、72 h Scr較實(shí)驗(yàn)前上升 >25%，腎組織病理切片HE染色可見(jiàn)大量腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、空泡變性、細(xì)胞脫落至小管腔，部分腎小管結(jié)構(gòu)破壞，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞腫脹、變性，系膜基質(zhì)輕度增多，腎間質(zhì)灶性水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，提示對(duì)比劑腎病大鼠模型是成功的。

在本研究中，各組大鼠（空白對(duì)照組除外）腎臟的病理切片中腎小球內(nèi)的細(xì)胞和基質(zhì)均表現(xiàn)出不同程度的增生，考慮可能與注射吲哚美辛和L-硝基-N-精氨酸甲酯有關(guān)，可能機(jī)制為：①吲哚美辛可抑制環(huán)氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）表達(dá)，導(dǎo)致前列腺素（PGs）生成減少[21]，而 PGs中的前列腺素 E1（prostaglandin E1，PGE1）可通過(guò)抑制血小板的聚集，降低血栓素 A2（thromboxane A2，TXA2）水平，減輕血管內(nèi)皮的損傷，使血漿內(nèi)皮素（entholia，ET）水平下降[22]。由于PGs減少導(dǎo)致ET生成增多。②L-NAME可以抑制NO的產(chǎn)生和釋放[23]，NO不僅能對(duì)抗ET的生物學(xué)效應(yīng)，而且負(fù)反饋抑制ET的釋放[24]。NO減少導(dǎo)致ET分泌增加[25]。而ET又通過(guò)自分泌和旁分泌的方式介導(dǎo)多種細(xì)胞因子，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的增生和細(xì)胞外基質(zhì)的形成[26]。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究了不同劑量EPO對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用[27]，以此為參照，本實(shí)驗(yàn)最大劑量采用3000 IU/kg。既往對(duì)中風(fēng)的嚙齒類動(dòng)物模型研究表明，EPO起組織保護(hù)作用的最小劑量為500 IU/kg，由于其他組織細(xì)胞EPO受體親和力小于骨髓造血細(xì)胞[29]，因此本實(shí)驗(yàn)最小劑量采用600 IU/kg。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射造影劑前預(yù)先給予rhEPO可明顯改善腎功能、減輕腎臟組織病理?yè)p傷，這表明rhEPO可有效減輕造影劑所誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷。實(shí)驗(yàn)表明，不同劑量rhEPO給藥干預(yù)均能使大鼠腎功能得到明顯的保護(hù)，但通過(guò)對(duì)腎功能和組織形態(tài)學(xué)的比較發(fā)現(xiàn)，大劑量給藥組效果優(yōu)于小劑量給藥組，但是rhEPO各干預(yù)組之間腎小管損傷評(píng)分并沒(méi)有明顯差異，分析可能是由于病理切片的選材、切片制作及實(shí)驗(yàn)樣本量較小的原因。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，rhEPO對(duì)造影劑誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷有保護(hù)作用，無(wú)論是從生化檢測(cè)還是從組織形態(tài)學(xué)方面都得到了證實(shí)，且大劑量干預(yù)組優(yōu)于小劑量干預(yù)組。這種作用可能是通過(guò)抗凋亡、抗氧自由基、減輕炎癥反應(yīng)、血管修復(fù)及促進(jìn)腎小管細(xì)胞再生的協(xié)同機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的，相信更多的依據(jù)將在以后的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。鑒于rhEPO在治療腎性貧血中已得到廣泛應(yīng)用，且副作用較小，應(yīng)用方便，故應(yīng)用于預(yù)防CIN的前景良好。但隨著rhEPO應(yīng)用劑量的增加，其帶來(lái)的副作用也隨之增加，諸如血栓形成、高血壓等，因此臨床上用于預(yù)防CIN的最佳合理劑量尚需更多的臨床研究加以評(píng)價(jià)。

[1]Nash K，Hafeez A，Hou S.Hospital-acquired renal insufficiency[J].Am J Kidney Dis，2002，39：930-936.

[2]Mccullough PA，Wolyn R，Rocher LL，et al.Acute renal failure after coronary intervention：incidence，risk factors，and relationship to mortality[J].Am J Med，1997，103：368-375.

[3]Toba H，Sawai N，Morishita M，et al.Chronic treatment with recombinant human erythropoietin exerts reno protective effects beyond hemato poiesis in streptozotocin-induced diabetic rat[J].Eur J Pharmacol，2009，612（1-3）：106-114.

[4]Brines M，Cerami A.Erythropoietin mediated tissue protection： reducing collateral damage from the primary injury response[J].J Intern Med，2008，264（5）：405-432.

[5]Gorio A，Gokmen N，Erbayraktar S，et al.Recombinant human erythro-poietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma [J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99：9450-9455.

[6]Ribatti D，Presta M，Vacca A，et al.Human erythropoietin induces a poranrgiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo[J].Blood，1999，93：2627.

[7]Toba H，Sawai N，Morishita M，et al.Chronic treatment with recombinant human erythropoietin exerts reno protective effects beyond hemato poiesis in streptozotocin-induced diabetic rat[J].Eur J Pharmacol，2009，612（1-3）：106-114.

[8]Lin F，Cordes K，Li L，et al.Hematopoietic stem cells contribute to the regeneration of renal tubules after renal ischemia-reperfusion injury in mice[J].J Am Soc Nephrol，2003，14：1188-1199.

[9]Agmon Y，Peleg H，Greenfeld Z，et al.Nitric oxide and prostanoids protect the renal outer medulla from radiocontrast toxicity in the rat[J].J Clin Invest，1994，94（3）：1069-1075.

[10]Paller MS，Hoidal JR，F(xiàn)erris TF.Oxygen Free Radicals in ischemicacute renal failure in the rat[J].J Clin Invest，1984，74：1156-1164.

[11]MorcosSK，Thomsen HS，Webb JA，et al.Contrast-media-induced nephrotoxicity：a consensus report[J].Eur Radiol，1999，9（8）：1602-1613.

[12]Heyman SN，Brezis M，Epstein FH，et al.Early renal medullar hypoxic injury from radio contrast and indo methacin[J].Kidney Int，1995，40（3）：632-642.

[13]Hoh Y，Yano T，Sendo T，et al.Involvement of denovo ceramide synthesis in radio contrast induced renal tubular cell injury E [J].Kidney Int，2006，69（2）：288-297.

[14]Dounousi E，Papavasiliou E，Makedou A，et al.Oxidative stress is progressively enhanced with advancing stages of CKD [J].Am J Kidney Dis，2006，48（5）：752-760.

[15]Persson PB，Tepel M.Contrast medium-induced nephropathy：the pathophysiology[J].Kidney Int，2006，（Suppl 1）：8-10.

[16]Steven F，John D，Kevin M，et al.N-acetyl cysteine in the prevention of radio contrast-induced nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2004，15（2）：251-259.

[17]Li F，Chong ZZ，Maiese K.Erythropoietin on a tightrope：Balancing neuronal and vascular protection between intrinsic and extrinsic pathways[J].Neurosignals，2004，13（6）：265-289.

[18]Dang J，Jia R，Tu Y，et al.Erythropoietin prevents reactive oxygen species generation and renal tubular cell apoptosis at high glucose level[OL].http：//dx.doi.Org/10.1016/j.biopha.2010-06-11.

[19]Shurtz SR，Kristal B，Shasha SM，et al.Interaction between erythropoietin and peripheral polymorphonuclear leukocytes in continuous ambulatory diaysis patients[J].Nephron，2002，91（4）：759-761.

[20]Ribatti D，Presta M，Vacca A，et al.Human erythropoietin induces a poranrgiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo[J].Blood，1999，93：2627.

[21]孔維信，顧勇，馬驥.腎大部切除大鼠腎皮質(zhì)環(huán)加氧酶2的表達(dá)及調(diào)節(jié)[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)，2005，32（11）：6-17.

[22]遲志波.前列腺素E1對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥及血漿內(nèi)皮素的影響[J].實(shí)用糖尿病雜志，2005，1（5）：55-56.

[23]Sosnovtseva OV，Pavlov AN，Pavlova ON，et al.The effect of L-NAME on intra-and inter-nephron synchronization[J].Eur J Pharm Sci，2009，36（1）：39-50.

[24]孫奧麗，孫永波，孫海峰.內(nèi)皮舒張因子和內(nèi)皮素之間調(diào)控關(guān)系動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36（3）：61-63.

[25]唐玉瓊，何小解.內(nèi)皮素與一氧化氮對(duì)腎病大鼠系膜細(xì)胞增生的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2002，12（19）：12-15.

[26]云鷹，曹廣海.清熱解毒、化瘀通絡(luò)方對(duì)系膜增生性腎炎大鼠腎組織腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素1的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué)，2010，2（3）：231-234.

[27]楊橙，胡林昆，趙天.重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)，2010，37（5）：539-543.