外源性甲狀腺素對梗阻性黃疸大鼠肝臟纖維化的保護作用研究

周志偉 莫海山 黎民宇 董啟超 樊津瑞 高 原

廣東省珠海市人民醫院，廣東 珠海 519040

肝臟是體內激素代謝的主要場所，大部分激素在肝臟滅活，或者與肝臟合成的轉運蛋白結合后執行生理功能，在肝臟功能損傷時，多伴有體內激素代謝異常，甲狀腺激素是體內生理作用最為廣泛的內分泌激素之一，其代謝及轉運均需肝臟合成的蛋白參與，在肝硬化等嚴重肝病時，甲狀腺激素的代謝多出現異常[1]，梗阻性黃疸是臨床常見的肝臟功能損傷原因，梗阻性黃疸不僅能夠引起肝臟組織壞死等急性損傷，在梗阻持續存在時，能夠引起肝臟膽汁性纖維化及硬化，引起肝臟的合成及儲備能力下降，本文就梗阻性黃疸大鼠肝臟損傷時甲狀腺激素代謝情況以及外源性甲狀腺激素對肝臟功能及纖維化損傷的保護作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、游離甲狀腺素（FT3、FT4）放免試劑盒（天津原子能公司），層粘連蛋白（laminin，LA）、透明質酸酶（hyaluronidase，HA）、Ⅲ型前膠原（type Ⅲ procollagen，PC-Ⅲ）及Ⅳ型膠原（type Ⅳcollagen，Ⅳ-C）檢測試劑盒（天津原子能公司），超氧化物歧化酶（super oxygen dehydrogenises，SOD）、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）檢測試劑盒（浙江碧云天生物試劑公司），大鼠甲狀腺素（南京建成生物工程研究所）。放免計數儀（天津原子能公司），分光光度計（常州醫用儀器廠）。

1.2 動物及分組與造模

32 只雄性 SD 大鼠，清潔級，6～8 周齡，體重（200±25）g，南方醫科大學實驗動物中心提供，大鼠室溫飼養適應環境后隨機數字表發分為四組，對照組、梗黃組、高劑組及低劑量組，梗黃組、高劑組及低劑量組大鼠采用膽總管結扎離斷法建立梗阻性黃疸大鼠模型[2]，對照組大鼠僅開腹翻動肝臟、游離膽總管后關腹。造模后各組大鼠分籠飼養，自由飲水，定量給食，間斷光照，室溫維持在20℃，高劑量組及低劑量組分別給予腹腔注射甲狀腺素，高劑量組給予 1 mL/（kg·d）（20 μg/mL）低劑量組給予 1 mL/（kg·d）（10 μg/mL）， 對照組及梗黃組每日腹腔注射生理鹽水1 mL，連續給藥4周。

1.3 標本采集

大鼠造模4周后，苯巴比妥麻醉后剪開心臟取血，分離血清后低溫保存，摘取肝臟組織，肝中葉組織冰凍保存，其余肝臟組織10%甲醛固定后石蠟包埋。

1.4 肝組織勻漿制備

幼鼠處死后立即開腹采集肝臟標本，制備肝組織勻漿，冰鹽水漂洗、剪碎，制備組織勻漿，勻漿介質（蒸餾水1000 mL，pH 7.4，EDTA-2Na 0.01 mol/L，Tris-HCl 0.1 mmol/L，0.8%NaCl溶液，蔗糖 0.01 mmol/L），組織勻漿后低溫高速離心（4000 g），吸取上清液2 mL冰凍保存待測。

1.5 標本檢測

血清標本及肝組織勻漿標本解溶后進行檢測，TSH、FT3、FT4、LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C檢測采用放免法， 肝組織勻漿MDA及SOD檢測采用比色法，檢測過程嚴格按照試劑及儀器使用說明書進行。

1.6 病理標本觀察

肝臟石蠟包面組織蠟塊采用4 μm厚度連續切片，常規HE染色，200目光鏡觀察并攝片。

1.7 統計學方法

數據處理采用SPSS 17.0漢語版統計學軟件，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較

造模4周后，高劑量組、低劑量組、梗黃組血清TSH、FT3及FT4水平較對照組明顯降低（均P<0.05），高劑量組、低劑量FT3、FT4下降程度較小，并且呈現劑量相關性。見表1。

表1 三組大鼠甲狀腺激素水平比較（）

表1 三組大鼠甲狀腺激素水平比較（）

注：與對照組比較，▲P<0.05；與梗黃組比較，▼P<0.05；與高劑量組比較，■P<0.05

2.2 各組大鼠肝組織氧化還原酶系活力比較

造模4周后，高劑量組、低劑量組、梗黃組肝組織勻漿SOD水平較對照組均下降（均P<0.05），MDA水平上升（均P<0.05），高劑量組、低劑量組肝組織勻漿SOD水平高于梗黃組（均 P<0.05），MDA 水平低于梗黃組（均 P<0.05），高劑量MDA水平低于低劑量組，SOD水平高于低劑量組，高劑量組及低劑量組之間SOD及MDA水平存在明顯差異（均P<0.05）。

表2 各組大鼠肝臟勻漿組織氧化指標比較（，nmol/mL）

表2 各組大鼠肝臟勻漿組織氧化指標比較（，nmol/mL）

注：與對照組比較，▲P<0.05；與梗黃組比較，▼P<0.05；與高劑量組比較，■P<0.05

表3 各組大鼠肝臟組織勻漿肝纖維化指標比較（，ng/mL）

表3 各組大鼠肝臟組織勻漿肝纖維化指標比較（，ng/mL）

注：與對照組比較，▲P<0.05；與梗黃組比較，▼P<0.05；與高劑量組比較，■P<0.05

2.3 各組大鼠肝臟組織肝纖維化指標比較

造模4周后，高劑量組、低劑量組及梗黃組大鼠肝組織勻漿LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度較對照組均升高 （均P<0.05），高劑量組及低劑量組肝組織勻漿LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度低于梗黃組（均P<0.05），高劑量組肝組織勻漿LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C濃度低于低劑量組（均P<0.05）。

2.4 各組大鼠肝臟組織結構比較

病理切片觀察結果顯示，對照組大鼠肝臟組織結構清晰，肝細胞排列規律；梗阻性黃疸組大鼠肝臟組織結構紊亂，纖維組織增多，肝臟小葉結構破壞，可見細胞變性壞死及炎細胞浸潤；低劑量及高劑量組大鼠肝臟組織結構整齊，可見點狀壞死及炎細胞浸潤，低劑量組炎癥細胞浸潤較高劑量組略多。見圖1～4。

3 討論

梗阻性黃疸是臨床常見疾病，梗阻性黃疸多由于膽總管的機械性梗阻引起的膽汁排泄障礙，伴隨膽道壓力的增高，膽汁發生反流，引起膽色素的代謝障礙，導致血液膽紅素水平升高，膽色素具有細胞毒性，能夠引起多器官系統的損傷。在梗阻性黃疸患者，多數都伴有明顯的肝臟功能及結構的損傷，膽色素能夠引起肝細胞蛋白激酶C介導的凋亡途徑的激活，導致肝細胞凋亡[3]。同時能夠引起肝臟內Toll樣受體及Fas等凋亡相關基因的過度表達，引起細胞的凋亡[4]，在梗阻性黃疸時，膽色素的毒性作用能夠引起細胞的變性壞死，導致肝臟的結構損傷。在肝臟損傷時，膽道壓力升高能夠導致門靜脈系統受壓，引起肝臟組織的缺血[5]，導致氧自由基多度生成，引起肝臟的氧化損傷及能量代謝障礙，氧化產物能夠引起肝臟星狀細胞增生及纖維組織的過度合成，導致肝纖維化及肝硬化[3-7]，引起肝臟的不可逆損傷。肝臟是體內最大的合成及代謝器官，大部分激素均在肝臟代謝，嚴重的肝臟病變往往引起體內激素代謝異常，如胰島素代謝紊亂、甲狀腺激素水平異常等。近年來的研究結果顯示[8-9]，在肝硬化患者體內多伴有甲狀腺激素的異常，其可能與肝病患者甲狀腺球蛋白的過度合成及甲狀腺激素轉化過程中關鍵酶的滅活障礙有關[10]，對肝病患者甲狀腺激素水平的檢測能夠評估患者的病情及預后，近年來有學者將小劑量甲狀腺素用于肝硬化腹水患者的治療，并且取得了較為理想的效果。

圖1 對照組肝臟組織（HE，×200）

圖2 梗黃組肝臟組織（HE，×200）

圖3 低劑量組肝臟組織（HE，×200）

圖4 高劑量組肝臟組織（HE，×200）

對梗阻性黃疸大鼠研究發現，在梗阻性黃疸大鼠體內存在甲狀腺激素代謝異常的情況，在梗阻性黃疸大鼠體內FT3、FT4水平降低，TSH并未出現反饋性的增高，而是同步降低，說明在梗阻性黃疸大鼠體內甲狀腺素的代謝及調節機制均出現異常，符合既往嚴重肝病患者正常甲狀腺病態綜合征的表現，在給予外源性甲狀腺素后，大鼠體內的甲狀腺素水平異常得到糾正，并且呈現劑量依賴性，在高度濃度干預組大鼠中表現出明顯的差異，提示外源性甲狀腺素能夠改善梗阻性黃疸大鼠體內的甲狀腺激素代謝異常，但是對于甲狀腺素軸的反饋異常尚無明顯的作用，大鼠體內TSH水平異常并未得到糾正。進一步的研究發現，給予甲狀腺激素后，大鼠肝組織勻漿LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C水平下降，肝臟纖維化得到改善，在病理結構的觀察中也證實，甲狀腺技術干預的梗阻性黃疸大鼠的肝臟結構損傷較輕，而未給予甲狀腺素的大鼠，肝臟組織出現明顯的變性、壞死及纖維化，肝臟的組織結構明顯破壞。對肝組織勻漿的氧化還原酶系活力檢測結果顯示，梗阻性黃疸大鼠肝臟組織MDA濃度升高而SOD濃度降低，說明氧化應激是梗阻性黃疸大鼠肝臟損傷的原因之一[11-12]，在給予甲狀腺素以后，大鼠肝臟組織的MDA濃度下降，SOD濃度上升，梗阻性黃疸大鼠肝臟氧化損傷的主要原因是肝臟組織的血液循環障礙及能量代謝障礙，甲狀腺激素能夠上調細胞Na+-K+-ATP酶的活性，促進細胞的能量代謝，同時也是膽汁分泌的原動力之一，其對細胞能量代謝的調節作用可能是減輕梗阻性黃疸大鼠肝臟氧化損傷及繼發的肝纖維的機制之一。本研究的結果顯示，外源性甲狀腺素能夠改善梗阻性黃疸大鼠甲狀腺激素代謝異常，減輕肝臟的氧化損傷，改善梗阻性黃疸大鼠肝臟纖維化，發揮對梗阻性黃疸肝臟損傷的保護作用。

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