晚期NSCLC患者外周血中EGFR突變檢測預測靶向治療的療效觀察

孫德弢 杜開齊 朱有才

武警浙江省總隊醫院胸心外科，浙江 嘉興 314000

約70%的非小細胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）患者在確診時已處于晚期。研究發現表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶結構域發生突變的NSCLC對靶向藥物的敏感性大為提高[1]。對具有EGFR突變的NSCLC患者，吉非替尼比起化療，死亡風險降低了52%，而厄洛替尼也可使50%的具有EGFR突變晚期NSCLC患者生存2年以上。但臨床上由于部分患者獲取病理標本有難度，所以傳統EGFR突變檢測方法具有局限性。外周血取材方便，通過血清檢測EGFR突變，如能達到與組織檢測相近的結果，那么則更有臨床實際意義。2008年1月～2012年3月筆者應用高分辨溶解曲線分析 （high-resolution melting analysis，HRM）技術，探討檢測外周血EGFR突變與晚期NSCLC一線口服吉非替尼治療的療效之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組64例患者，其中男21例，女43例，年齡42～76歲，平均61.3歲。所有患者均為初治，經胸腹部CT、頭顱核磁共振、全身骨ECT等檢查，確定臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者。病理學分型：鱗癌12例，腺癌49例，非小細胞低分化癌3例。

1.2 方法

1.2.1 血漿循環DNA提取與HRM檢測 經前臂靜脈采集外周血液5 mL，置潔凈抗凝離心管，4℃離心10 min，吸取上清液轉移至1.5 mL離心管中，于4℃下離心10 min，分裝后置-80℃冰箱中保存。解凍后，按高通量血液DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，溶于50 μL滅菌水中。經微量紫外可見分光光度計測定DNA純度及含量，提取的DNA放置-20℃冰箱儲存。設計上下游引物。PCR反應條件為96℃ 2 min，96℃5 s，60℃ 5 s，72℃ 25 s，45 個循環。PCR 擴增完后，擴增產物進行HRM 分析。HRM 分析條件：95℃ 5 min，40℃ 2 min，60℃1 min，然后以0.1℃/s的速度從65℃升溫至95℃收集溶解曲線數據，進行實時數據分析。

1.2.2 治療方法 對檢測出存在EGFR基因突變的患者（A組）口服吉非替尼250 mg/d，服藥時間最短2個月，最長32個月。對檢測不存在EGFR基因突變的患者（B組）給予多烯紫杉醇加順鉑化療，療程4～6個。在初始治療期間不采用其他的抗腫瘤治療，直到腫瘤進展或患者不能耐受藥物不良反應而終止治療。對于腦轉移及孤立的骨轉移灶行放療。

1.3 療效評價標準

療效分為完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（partial remission，PR）、穩定（stable disease，SD）和進展（progressive disease，PD），CR和PR要在距離首次評價至少 4周后再次確認，計算有效率（response rate，RR）和疾病控制率（disease control rate，DCR）。定期復查胸腹部CT、頭顱增強MRI及全身同位素骨掃描，進行療效判定。無進展生存期（Progressive-free survival，PFS）為患者開始治療直至PD的時間。 RR=（CR+PR）/總數×100%。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 20.0對實驗數據進行分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法分析兩組患者的生存率差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

64例患者中，有24例（37.5%）可檢測出外周血EGFR突變，5例患者因各種原因未進行吉非替尼治療，其余19例患者治療后CR+PR為13例，RR為68.4%，DCR為73.7%，中位PFS為12.0個月；在未檢出突變的40例患者中，8例患者因各種原因未進行化療，其余32例患者化療后CR+PR為12例，RR為37.5%，DCR為43.8%，中位PFS為7.3個月。A組的RR與B組比較，差異有統計學意義 （χ2=4.561，P=0.033），A組的 DCR與 B組比較差異有統計學意義 （χ2=4.314，P=0.038）。 經 log-rank 檢驗，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，A組的生存率高于 B組 （圖 1）（χ2=7.406，P=0.006）。

圖1 兩組PFS的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

2008年被美國臨床腫瘤學會列為肺癌主要進展的血清檢測EGFR突變研究，成功拓展了組織取材范圍，使得EGFR檢測的臨床實用性更強。本研究所采用的HRM檢測技術原理是在一定的溫度范圍內將PCR擴增的產物進行變性，期間實時檢測體系內熒光信號。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨特的序列，因而也就有了獨特的溶解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩定性和重復性。國內學者[2-3]應用HRM法檢測肺癌患者血漿EGFR基因突變，經基因測序法驗證，結果具有高度相關性。本組中有24例（37.5%）可檢測出外周血EGFR突變，可能與腺癌、女性比例較高有關。

肺癌傳統的化療由于缺乏特異性，取得療效的同時也往往給患者帶來較大的毒副作用，其有效率僅為30%～40%。因此，選擇肺癌細胞特異的分子靶點進行治療，在取得明顯療效的同時，又可以避免對正常細胞的損害。晚期NSCLC的個體化治療將成為肺癌臨床治療的新模式。Wu等[4]研究表明EGFR突變亞組吉非替尼的無進展生存時間明顯優于紫杉醇加卡鉑。Sirera等[5]的研究中對EGFR敏感突變（19和21外顯子突變）的患者，均給予厄洛替尼治療，總體生存率較化療延長了2～3倍，客觀有效率遠遠高于常規化療。本研究結果也表明A組的RR和DCR與B組比較差異均具有統計學意義（均P<0.05）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，A組的生存率高于B組（P<0.05）。檢測EGFR基因突變對于實現個體化治療具有重要意義，對EGFR突變狀態不明的患者盲目使用這類靶向藥物，會增加EGFR野生型患者的疾病進展風險。一線靶向藥物選擇的關鍵是如何更準確、方便、有效地篩選出EGFR突變患者，這是一線靶向治療獲益的基本保證。然而，臨床上晚期患者病理標本獲取率較低，制約了一線靶向治療的應用。周小昀等[6]認為外周血EGFR突變檢測結果與臨床評估分子靶向治療療效較為符合。本研究結果也表明對不能夠獲得足夠病理標本的患者通過血清檢測EGFR突變狀態，在治療上具有一定的指導意義。

[1]Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al.EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy [J].Science，2004，304（5676）：1497-1500.

[2]高菲，師建國，魏金花，等.HRM法檢測肺癌EGFR基因突變[J].現代腫瘤醫學，2011，19（6）：1089-1092.

[3]趙瑾，彭群新，楊炳華，等.應用HRM法檢測肺癌患者循環DNA中表皮生長因子受體基因突變[J].中華醫學雜志，2011，19（10）：674-678.

[4]Wu YL，Chu DT，Han B，et al.Phase Ⅲ，randomized，open-label，firstline study in Asia of gefitinib versus carboplatin/paclitaxel in clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer：evaluation of patients recruited from mainland China [J].Asia Pac J Clin Oncol，2012，8（3）：232-243.

[5]Sirera R，Gil M，Blasco A，et al.Retrospective analysis of the prognostic role of p16 protein inactivation in plasma in patients with locally advanced non-small cell lung cancer [J].Lung Cancer，2008 ，61（1）：104-108.

[6]周小昀，李龍蕓，崔巍，等.檢測肺癌患者血清游離DNA的EGFR基因點突變與 EGFR-TKI療效的相關性分析[J].癌癥進展，2011，9（1）：13-18.