索拉非尼抑制人肝星狀細胞膠原合成*

高俊茶，王 妍，姜慧卿△

(1河北醫科大學第二醫院消化科，河北省消化病重點實驗室，河北省消化病研究所，2河北省人民醫院消化內科，河北 石家莊 050051)

肝纖維化系指肝組織內細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度增生與異常沉積，其中尤以I型膠原為主［1］，最終導致肝臟結構和功能異常的病理變化，進而發展為肝硬化。而活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)合成和分泌細胞外基質，是肝纖維化發生發展的中心環節。我們之前的研究發現酪氨酸激酶活化與肝纖維化的發生有關，索拉非尼(sorafenib)是一種強效多靶點酪氨酸激酶抑制劑，以Raf、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)和血小板源性生長因子受體(platelet－derived growth factor receptor，PDGFR)為靶點發揮抑制細胞增殖和血管生成的雙重作用［2］。我們的研究發現索拉非尼可抑制肝纖維化大鼠肝臟膠原的合成和分泌，在體外抑制肝星狀細胞增殖，促進肝星狀細胞凋亡［3］;其在體外對肝星狀細胞膠原合成的影響尚需進一步研究。本文旨在應用索拉非尼干預人肝星狀細胞，在體外研究索拉非尼對肝星狀細胞膠原合成的影響，以期為尋找防治肝纖維化藥物提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

1.1 肝星狀細胞株 人肝星狀細胞細胞株LX－2由美國Scott L.Friedman教授惠贈。

1.2 主要試劑 索拉非尼購自Alexis;PDGF購自PeproTech;DMEM和 FBS購自 Gibco;L－［2，3－3H］－脯氨酸和閃爍液均購自PerkinElmer;I型膠原多克隆抗體購自Santa Cruz;SP試劑購自北京中山生物技術公司;RNA提取試劑Trizol reagent購自Invitrogen;逆轉錄酶(AMV－RT)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)、隨機引物(random primers)和瓊脂糖(agarose)均購自Promega。

2 方法

2.1 肝星狀細胞的體外培養 將冷凍保存于液氮中的肝星狀細胞復蘇后接種于含10%胎牛血清、1×105IU·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素、4 mmol·L－1谷氨酰胺及1 mol·L－1HEPES的DMEM培養液中，37℃、5%CO2培養至細胞呈單層接近融合時進行實驗。每次實驗均在呈指數生長的細胞中進行，接種(3×107)～(5×107)·L－1細胞于25 cm2培養瓶或以2.0 ×107·L－1的密度接種 1.5 mL 制備細胞爬片，或以2.5×107·L－1的密度1 mL接種于24孔板，培養箱中孵育至細胞接近80% ～90%融合時，換不含胎牛血清的DMEM培養液繼續培養24 h，使細胞同步化于G0期后進行分組。

2.2 免疫細胞化學法檢測I型膠原蛋白的表達 取呈指數生長的肝星狀細胞制備細胞爬片。按上述方法進行同步化后分組如下:(1)對照組;(2)PDGF組(PDGF 100 μg·L－1);(3)PDGF+sorafenib(10.0 μmol·L－1)組。加入處理因素后24 h收集細胞爬片，單層肝星狀細胞爬片經4%多聚甲醛固定，3%過氧化氫室溫孵育，微波爐抗原修復，5%正常羊血清封閉后，加入Ⅰ抗體I型膠原多克隆抗體1∶100，37℃孵育1 h，PBS清洗，加辣根過氧化物酶復合物孵育50 min后，DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結果判定:細胞內棕褐色染色為陽性。陰性對照用PBS替代Ⅰ抗。應用麥克奧迪數碼醫學圖像分析系統測量I型膠原蛋白的陽性表達，以陽性平均吸光度值計算表達強度。

2.3 ［3H］脯氨酸摻入實驗測定細胞膠原合成能力 依據文獻［4］介紹的方法稍作修改，測定［3H］－脯氨酸的摻入。肝星狀細胞同步化后分組如下:(1)對照組;(2)PDGF 組(PDGF 20 μg·L－1);(3)PDGF+sorafenib(2.5 μmol·L－1)組;(4)PDGF+sorafenib(5.0 μmol·L－1)組;(5)PDGF+sorafenib(10.0 μmol·L－1)組;(6)sorafenib(2.5 μmol·L－1)組;(7)sorafenib(5.0 μmol· L－1)組;(8)sorafenib(10.0 μmol·L－1)組。每組平行設 6 個復孔，PDGF的濃度均為20 μg·L－1，在相應時點收集細胞。實驗終止前24 h每孔加入L－［2，3－3H］－脯氨酸1.85 ×104Bq。在 PDGF(20 μg·L－1)刺激 2 h 后或是在沒有PDGF作用下，分別加入不同濃度sorafenib(2.5 μmol·L－1、5.0 μmol·L－1和 10.0 μmol·L－1)作用12 h、24 h及48 h后收集上清液，每孔上清液等分為2份，分別移入2 mL Eppendorf管:一管加I型膠原酶0.5 g·L－1，另一管為空白對照管，置37℃恒溫作用90 min;之后每管加50%三氯醋酸500 μL冰上作用1 h，并于4℃、5000 r/min離心10 min去上清，每管加入2 mL閃爍液溶解沉淀物，置于閃爍杯中，于液體閃爍記數儀上測定樣品counts/min值。按照下列公式計算:

膠原含量=空白管沉淀物counts/min－膠原酶管沉淀物counts/min。

［3H］脯氨酸摻入率(%)=(實驗組放射性活度/對照組放射性活度)×100%。

［3H］脯氨酸摻入抑制率(%)=［(對照組放射性活度－實驗組放射性活度)/對照組放射性活度］×100%。

2.4 Real－time PCR檢測 I型膠原 α1 mRNA表達水平 取呈指數生長的細胞按上述方法進行同步化分組如下:(1)對照組;(2)PDGF組;(3)PDGF+sorafenib(2.5 μmol·L－1)組;(4)PDGF+sorafenib(5.0 μmol·L－1)組;(5)PDGF+sorafenib(10.0 μmol·L－1)組，PDGF 均為 100 μg·L－1，加入處理因素后24 h收集細胞。采用Trizol試劑盒，按照說明書操作，一步法提取人肝星狀細胞總RNA，電泳鑒定RNA并定量，逆轉錄合成cDNA;I型膠原α1及內參照甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物參照GenBank基因序列自行設計，由上海生物工程公司合成。引物設計與合成如下:I型膠原α1鏈上游引物5'－CAGGCTGGTGTGATGGGATT－3'，下游 引物 5'－CCAAGGTCTCCAGGAACACC－3'，擴增產物大小為279 bp。GAPDH上游引物5'－ACTTTGGTATCGTGGAAGGACT－3'，下游引物 5'－ GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT－3'，擴增產物大小為133 bp。在PE 5700實時熒光定量PCR儀(ABI)上進行實時定量擴增。SYBR反應體系40 μL。PCR反應條件:96℃ 4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環;72℃ 延伸5 min。利用實時熒光定量PCR儀自帶軟件進行分析，獲得產物的 Ct值。采用2－ΔΔCt法分析實時定量PCR基因表達的相對變化。

3 統計學處理

結 果

1 索拉非尼抑制LX－2細胞I型膠原蛋白表達

免疫細胞化學染色顯示:PDGF刺激使LX－2細胞I型膠原蛋白表達增加，而索拉非尼干預24 h能夠明顯降低I型膠原蛋白的表達;對照組、PDGF刺激組和索拉非尼干預組I型膠原平均吸光度分別為0.244±0.022、0.340±0.023和0.224±0.017(P＜0.01)，差異有統計學意義，見圖1。

2 索拉非尼抑制LX－2細胞［3H］－脯氨酸摻入率的量效關系

析因設計的方差分析顯示，PDGF和索拉非尼無交互作用(P ＞0.05);20 μg·L－1PDGF作用 LX －2細胞48 h可使［3H］－脯氨酸摻入率增加1.2倍(P＜0.01)，差異有統計學意義;2.5 ～10.0 μmol·L－1索拉非尼48 h后對LX－2細胞［3H］－脯氨酸摻入有抑制作用(P＜0.01);無論有無PDGF的刺激，索拉非尼在2.5 ～10.0 μmol·L－1范圍內，濃度越高，對肝星狀細胞［3H］－脯氨酸摻入的抑制作用越強(P＜0.01)，見表1，表明索拉非尼對肝星狀細胞膠原合成的抑制作用呈劑量依賴關系。

Figure 1.Sorafenib inhibits type I collagen expression increased by PDGF in LX－2 cells(immunocytochemical staining，× 400).A:control;B:PDGF(100 μg/L);C:PDGF+sorafenib(10.0 μmol/L).圖1 免疫細胞化學法檢測LX－2細胞經PDGF刺激及索拉非尼干預24 h后I型膠原的表達

表1 索拉非尼呈濃度依賴性抑制LX－2細胞［3H］－脯氨酸摻入率Table 1.Sorafenib dose－dependently inhibited［3H］－proline incorporation rate in LX－2 cells(%..n=6)

表1 索拉非尼呈濃度依賴性抑制LX－2細胞［3H］－脯氨酸摻入率Table 1.Sorafenib dose－dependently inhibited［3H］－proline incorporation rate in LX－2 cells(%..n=6)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs PDGF group.

Control 100.00 ±0.00 PDGF(20 μg/L) 120.80 ±15.40#PDGF+sorafenib(2.5 μmol/L) 84.19 ±10.83*PDGF+sorafenib(5.0 μmol/L) 68.35 ±7.86*PDGF+sorafenib(10.0 μmol/L) 52.05 ±13.56*Sorafenib(2.5 μmol/L) 70.67 ±12.19#Sorafenib(5.0 μmol/L) 56.60 ±14.97#Sorafenib(10.0 μmol/L) 31.55 ±8.70#

3 索拉非尼抑制LX－2細胞［3H］－脯氨酸摻入率的時效關系

索拉非尼可以抑制LX－2細胞的［3H］－脯氨酸摻入作用，隨著時間延長，10.0 μmol·L－1索拉菲尼對肝星狀細胞［3H］－脯氨酸摻入抑制率逐漸增加，在12 h、24 h和48 h［3H］－脯氨酸摻入抑制率分別為22.69%、37.52%和71.74%(P＜0.01)，見表2，表明索拉非尼抑制人肝星狀細胞膠原合成具有時間依賴關系。

4 索拉非尼抑制LX－2細胞I型膠原 α1 mRNA的表達

在real－time PCR實驗中，以熒光值和循環數作圖，自動得到mRNA水平擴增曲線，可見各樣品的重復性較好，擴增效率基本一致。應用相對定量2－ΔΔCt法比較I型膠原 α1 mRNA在不同分組中的表達。結果表明:100 μg·L－1PDGF作用于LX－2細胞24 h，顯著增加I型膠原α1 mRNA表達，索拉非尼干預可以抑制 I型膠原 α1 mRNA表達，在2.5～10.0 μmol·L－1范圍內，索拉非尼呈劑量依賴性地抑制100 μg·L－1PDGF 誘導的 I型膠原 α1 mRNA 的表達上調(2.14±0.13，1.78±0.04，0.94±0.10 vs2.79 ±0.12，P＜0.01)，差異有統計學意義，見圖2和表3。

表2 索拉非尼 (10.0 μmol/L)呈時間依賴性提高LX－2細胞［3H］－脯氨酸摻入抑制率Table 2.Sorafenib(10.0 μmol/L)time － dependently increased the inhibitory rate of［3H］－proline incorporation in LX－2 cells(%..n=6)

表2 索拉非尼 (10.0 μmol/L)呈時間依賴性提高LX－2細胞［3H］－脯氨酸摻入抑制率Table 2.Sorafenib(10.0 μmol/L)time － dependently increased the inhibitory rate of［3H］－proline incorporation in LX－2 cells(%..n=6)

#P ＜0.05 vs 0 h;*P＜0.05 vs 12 h;△P ＜0.05 vs 24 h.

Time(h)Inhibitory rate 0.00 ±0.0012 22.69 ±4.41#24 37.52 ±6.10#*48 71.74 ±6.37#＊△0

Figure 2.The mRNA expression of collagen α1(I)after different interventions in LX－2 cells..n=6.#P＜0.05 vs control;*P ＜0.05 vs PDGF group.圖2 索拉非尼和PDGF對LX－2細胞I型膠原α1 mRNA表達的影響

表3 索拉非尼呈劑量依賴性抑制PDGF誘導的I型膠原α1 mRNA的表達Table 3.Sorafenib inhibited collagen α1(I)mRNA expression increased by PDGF in a dose－dependent manner detected by real－time PCR(.n=6)

表3 索拉非尼呈劑量依賴性抑制PDGF誘導的I型膠原α1 mRNA的表達Table 3.Sorafenib inhibited collagen α1(I)mRNA expression increased by PDGF in a dose－dependent manner detected by real－time PCR(.n=6)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs the PDGF group.

Control 1.03 ±0.23 PDGF(100 μg/L) 2.79 ±0.12#PDGF(100 μg/L)+sorafenib(2.5 μmol/L)2.14 ±0.13*PDGF(100 μg/L)+sorafenib(5.0 μmol/L)1.78 ±0.04*PDGF(100 μg/L)+sorafenib(10.0 μmol/L)0.94 ±0.10)*

討 論

索拉非尼是一種新型口服強效多靶點酪氨酸抑制劑，以 Raf、VEGFR和 PDGFR為靶點，通過阻斷Ras/Raf/MAPK(mitogen activated protein kinase)和PI3K(phosphatidylinositol 3－kinase)/Akt信號通路而抑制腫瘤細胞增殖和血管生成［2，5］。Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt信號通路是調控肝纖維化發生發展的2條重要信號途徑。李驄等［6］發現中藥肝復康通過非特異性干擾PDGF功能，阻斷Ras/MAPK通路，抑制I型膠原和α－平滑肌肌動蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)mRNA的轉錄，以達到抗纖維化的作用。研究發現索拉非尼能夠降低肝纖維化大鼠門脈壓力、減輕肝纖維化和改善肝功能［7－9］。索拉非尼對肝星狀細胞膠原合成的影響目前尚不甚清楚，我們采用一種研究人肝纖維化的理想細胞模型LX－2，體外研究索拉非尼對肝星狀細胞膠原合成的影響。

通過［3H］－脯氨酸摻入實驗發現，無論在PDGF刺激或非刺激情況下，LX－2細胞膠原合成均明顯受到抑制，且抑制程度與索拉非尼濃度呈劑量和時間依賴關系，表明索拉非尼對LX－2細胞膠原合成有顯著抑制效應，而抑制肝星狀細胞膠原合成又是肝纖維化逆轉的關鍵。我們的前期研究發現:索拉非尼能減輕膽總管結扎和二甲基亞硝胺所致肝損傷大鼠的纖維化程度。最近Thabut等［10］通過磁共振、組織化學等方法也發現索拉非尼對膽總管結扎慢性肝損傷大鼠肝臟細胞外基質的重塑具有調節作用，認為對以大量纖維組織和新生血管增生為特征的慢性肝病是一種很好的治療選擇，可見索拉非尼這種在體內外均具有的抑制肝纖維化發生的作用使其成為一種極具潛力的肝纖維化治療藥物。

以I型膠原為主的ECM在肝臟內過度增生與沉積是肝纖維化的主要特征，活化的肝星狀細胞是其主要來源［1，11］。人肝星狀細胞細胞株LX－2表達I型膠原α1，而活化肝星狀細胞中I型膠原α1的表達在肝纖維化形成中起著關鍵作用。楊雅麗等［12］發現PDGF－B反義寡脫氧核苷酸可以抑制肝星狀細胞的增殖、I型膠原的合成。動物實驗研究表明:隨著肝纖維進展，肝星狀細胞活化增殖，I型膠原α1、α2 mRNA表達上調，膠原合成增加［13］。應用S－亞硝基－N－乙酰半胱氨酸干預發現，隨著肝纖維化減輕，I型膠原 α1和 α －SMA 表達下調［14］。Lee等［15］應用脂質分化相關蛋白(adipose differentiation－related protein，ADRP)質粒載體可使活化肝星狀細胞恢復到靜止狀態，α－SMA表達降低，發現伴隨著肝星狀細胞失活，I型膠原mRNA表達下調，肝纖維化程度減輕;而用siRNA抑制ADRP表達可以使上述變化逆轉。Panakanti等［16］應用三聚寡核苷酸多肽(triplex forming oligonucleotides，TFO)干預膽總管結扎肝纖維化大鼠，發現在減輕肝纖維化的同時I型膠原基因表達受到抑制。本研究發現索拉非尼可以顯著降低LX－2 I型膠原α1 mRNA表達水平，且呈明顯的量效關系;與此同時免疫細胞化學方法也證明了sorafenib可以顯著抑制I型膠原蛋白的表達，表明索拉非尼在蛋白水平和mRNA水平均能夠抑制I型膠原表達。

索拉非尼作為一種小分子多靶點的生物靶向治療新藥，能夠從蛋白和mRNA水平抑制I型膠原表達，對人肝星狀細胞膠原合成有顯著抑制效應，表明索拉非尼有可能成為預防和治療肝纖維化的一種新藥物。

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