NRF2/PI3K通路介導肝癌細胞SMMC-7721出現(xiàn)索拉非尼耐藥的機制研究

段俊偉 倪文

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種實質性臟器的高惡性度腫瘤，疾病進展快，預后多不佳[1]。肝癌治愈的唯一方法仍為手術切除，化療藥物已成為治療肝癌的治療手段之一，但肝癌細胞對不少化療藥物存在明顯耐藥，增加了臨床治療難度[2]。隨著分子靶向治療藥物的不斷開拓，索拉非尼是 NCCN 指南推薦的晚期肝癌治療的首選方案[3]。 但索拉非尼長期服用會出現(xiàn)耐藥，延長肝癌患者生存期僅不足 3 個月，最終導致治療失敗[4]。索拉非尼于2008年作為第一個HCC的全身治療藥物獲批上市，索拉非尼在臨床上的口服制劑為多激酶抑制劑，可抑制VEGF、KIT以及下游Raf信號等并直接抑制腫瘤的增殖以及腫瘤新生血管的生成[5,6]。本研究擬首先建立親本SMMC-7721細胞株以及SMMC-7721-SR耐藥株，而后檢測索拉非尼對細胞活性的抑制作用，借此探討NRF2/PI3K相關通路與HCC患者索拉非尼耐藥發(fā)生風險之間的關聯(lián)機制。

資料與方法

一、細胞株的培養(yǎng)建立

親本的SMMC-7721細胞株培養(yǎng)通過將細胞株均接種于胎牛血清完成(胎牛血清，取濃度10%，且含高糖 DMEM)，培養(yǎng)箱孵育(孵育條件： 37 ℃、5% CO2)；隨后將肝癌SMMC-7721細胞在索拉非尼培養(yǎng)液中培養(yǎng)(0.5 μmol/L)，待培養(yǎng)穩(wěn)定后使用濃度梯度遞增法完成耐藥細胞株的建立(即SMMC-7721-SR細胞株)，直至細胞能在索拉非尼的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。

二、NRF2-siRNA質粒構建和轉染

構建NRF2-siRNA質粒，按照 lipofectamine 2 000 的操作說明對肝癌細胞SMMC-7721進行轉染，驗證質粒及 siRNA 的轉染效率。siRNA 序列參照文獻設計并由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。 序列為：(1)NRF2 正義鏈：GCACCUUAUAUCUCGA-AGUTT；反義鏈：ACUUCGAGAUAUAAGGUGC-TT。對照siRNA:正義鏈：UUCUCCGAACGUGUC-ACGUdTdT；反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAG-AAdTdT。

三、細胞存活率的測定

細胞存活率測定在本次研究中使用CCK-8法檢測完成：抑制NRF2 mRNA表達并給予索拉非尼處理后，SMMC-7721細胞株及SMMC-7721-SR細胞株換培養(yǎng)液后接種于96孔板中，換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)基添加10ul 的CCK8，培養(yǎng)時間2 h)，測定OD值，計算細胞存活率。

四、細胞凋亡率的測定

對于SMMC-7721細胞株，抑制NRF2 mRNA表達并給予索拉非尼處理，完成細胞株以及耐藥株細胞懸液的制作，采用TUNEL試劑盒進行逐步操作。在顯微鏡下查找熒光陽性細胞，判斷SMMC-7721細胞株及SMMC-7721-SR細胞的凋亡率。

五、檢測相關 mRNA表達

借助Real-time PCR完成相關mRNA 的定量測定，使用Trizol提取總RNA，逆轉錄，完成PCR實驗。比較閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold, CT)值等。

六、Western Blot檢測NRF2、Keap1、ARE以及PI3K、Akt蛋白的表達

取肝癌細胞冰上裂解2 h并低溫離心，提取組織中蛋白上清液，加入20 μg/μL蛋白樣品至SDS凝膠(10%)，電泳轉膜，隨后分別加入對應的抗體，使用堿性磷酸酶二抗進行抗體孵育，顯色劑DAB顯色。計算各組條帶中NRF2、Keap1、ARE、PI3K和Akt蛋白表達量。

七、統(tǒng)計學處理

結 果

一、細胞存活率測定結果

索拉非尼可明顯抑制肝癌細胞SMMC-7721的存活率(P<0.05)，索拉非尼對SMMC-7721-SR細胞存活率沒有明顯影響(P>0.05)。抑制NRF2 mRNA表達并給予索拉非尼處理后，SMMC-7721-SR細胞存活率明顯降低(P<0.05)。

二、細胞凋亡率測定結果

與對照組對比分析結果提示，索拉非尼可增加SMMC-7721 凋亡 (P<0.05)；與耐藥細胞株對比，其對SMMC-7721的凋亡促進作用更強(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表達并給予索拉非尼處理，耐藥細胞凋亡率增加(P<0.05)。

四、Real-Time PCR檢測基因水平表達

SMMC-7721-SR細胞中NRF2 mRNA表達明顯高于SMMC-7721細胞，Keap1、ARE、PI3K和Akt mRNA表達明顯增加(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表達并給予索拉非尼處理后，NRF2、Keap1、ARE、PI3K和Akt mRNA表達明顯降低(P<0.05)。

五、Western Blot檢測蛋白含量表達

SMMC-7721-SR細胞中NRF2 蛋白水平明顯高于SMMC-7721細胞，Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白水平明顯增加(P<0.05)。抑制NRF2 mRNA表達并給予索拉非尼處理后，NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt 蛋白水平明顯降低(P<0.05)。

討 論

肝癌作為第六大最常見的惡性腫瘤，占新發(fā)癌癥病例的5.7%，也是全球癌癥相關死亡的第二大殺手[7]，在成人的原發(fā)性肝腫瘤中，肝細胞癌(HCC)是最常見的[8-9]。索拉非尼單獨或與其他藥物聯(lián)合進行局部靶向干預可以有效增加晚期肝癌患者的生存時間，美國 FDA已經批準認可索拉非尼作為干預晚期肝癌的重要靶向藥物[10]。索拉非尼的抗腫瘤功效主要通過抑制 Raf MEK ERK相關通路，可以有效阻止腫瘤的生長，與此同時其還可以調控VEGF表達，間接減低腫瘤發(fā)生和進展[11-14]。但長期服藥索拉非尼，會引起患者出現(xiàn)獲得性耐藥[15]，因此探討相關耐藥機制并在此基礎上開發(fā)有效阻控干預意義重大。

本次研究中可見索拉非尼對肝癌細胞SMMC-7721的存活率具有明確的抑制作用，促進細胞株凋亡；索拉非尼耐藥細胞株中腫瘤細胞凋亡明顯減少。提示索拉非尼可以有效抑制SMMC-772活性，索拉非尼作用下，SMMC-7721細胞NRF2 蛋白水平及mRNA含量增高，另外本研究中分析的幾種蛋白水平也可見高表達，并且相關mRNA表達也增加，提示索拉非尼調控NRF2/PI3K信號通路，但對耐藥株SMMC-7721-SR的促凋亡作用并不明顯。抑制NRF2 mRNA表達并給予索拉非尼處理后，耐藥株SMMC-7721-SR細胞中NRF2/Keap1通路蛋白水平明顯降低，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率升高。說明肝癌細胞下調siRNA-NRF2 基因后，促進了耐藥株SMMC-7721-SR細胞出現(xiàn)凋亡，而非耐藥SMMC-7721細胞株索拉非尼單藥效果更為敏感， 抑制 NRF2 可逆轉肝癌對索拉非尼耐藥，索拉非尼持續(xù)作用直接導致NRF2/PI3K通路的激活，引發(fā)肝癌對索拉非尼獲得性耐藥。

表1 索拉非尼處理SMMC-7721細胞和SMMC-7721-SR細胞基因水平表達

表2 抑制NRF2 mRNA表達后，肝癌耐藥細胞SMMC-7721-SR基因水平表達

表3 索拉非尼處理SMMC-7721細胞和SMMC-7721-SR細胞基因水平表達

表4 抑制NRF2 mRNA表達后，肝癌耐藥細胞SMMC-7721-SR基因水平表達