Cyr61作為對乙酰氨基酚致急性肝損傷的潛在預后生物學標志物研究

朱景麗 黃亞彬 何麗娟

對乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol, paracetamol, APAP)是一種廣泛應用于臨床的非處方解熱鎮痛藥，過量使用APAP可導致嚴重的肝損傷[1]。當肝臟發生壞死損傷時，血清酶ALT和AST的升高可作為肝損傷的指標，然而它們對預測肝損傷或急性肝功能衰竭的嚴重程度并不敏感[2]。因此有必要尋找新型、特異性及靈敏度高的生物學標志物以指導臨床診療工作。

Cyr61是結締組織生長因子家族(CCN)的一員，在細胞增殖、黏附、遷移、血管生成和凋亡等方面發揮重要作用[3]。經研究發現Cyr61有希望成為急性心肌損傷及腎損傷的早期標志物[4-5]。在肝臟疾病研究中，Cyr61與促進肝纖維化的消退、肝星狀細胞凋亡以及肝癌的發生有關[6]。目前尚無關于APAP誘導的肝損傷患者血漿或肝臟Cyr61水平變化的報道。因此，本研究通過制備APAP化學性急性肝損傷大鼠模型，檢測大鼠血漿和肝臟中Cyr61濃度是否發生變化。

資料與方法

一、動物與試劑

健康SPF級雄性Wistar大鼠92只，體質量200～250 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。實驗動物自由飲水和進食，飼養環境溫度為22～25 ℃，循環光照(12 h亮/12 h暗)，適應環境1周后開始實驗。APAP處理前禁食12 h。APAP(美國Sigma公司)，TRIzol裂解液(美國Invitrogen公司)，PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(日本TAKARA公司)，SYBR Premix Ex Taq(日本TAKARA公司)，qRT-PCR引物(上海生物化工有限公司)；鼠Cyr61 Elisa試劑盒(英國Abcam公司)。

二、實驗方法

(一)急性肝損傷模型的制備 大鼠隨機分為2組(每組n=10)：對照組、APAP處理組。APAP處理組通過胃管給予250 g/kg體質量的APAP(重懸于0.9%生理鹽水，加熱溶解，終濃度為25 mg/mL)，對照組胃管給予0.9%生理鹽水[7]。處理24 h后處死大鼠，收集2組大鼠血清和肝組織，常規檢測血清ALT和AST表達水平，肝組織檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和谷胱甘肽(GSH)水平，結果示：與對照組相比，APAP處理組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.05)；APAP處理組肝組織中的SOD、GSH水平明顯增加(P<0.05)，MDA和NO水平顯著降低(P<0.05)，提示APAP誘導大鼠藥物性肝損傷模型成功建立。

(二)動物處理 大鼠隨機分為3組(每組n=24)：對照組、APAP處理組、APAP+還原型谷胱甘肽(阿拓莫蘭, GSH)治療組(模型建立24 h后尾靜脈注射GSH 400 mg/kg)[8]。每組在模型建立后在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分別取4只大鼠留取血清，常規檢測ALT、AST。收集血清后處死大鼠，留取肝組織部分進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。

(三)qRT-PCR測肝組織Cyr61 mRNA相對水平 TRIzol法提取血漿和肝組織的mRNA，260 nm波長測得RNA濃度，經逆轉錄獲得cDNA，使用SYBR Green擴增目的基因，GAPDH作為管家基因，2-△△Ct法計算mRNA表達水平的變化倍數，引物序列如下：Cyr61前引物(5′-3′)CGCGAAGC-AACTCAACGAGG，后引物(5′-3′)GAGACAGTTCTT-GGGGACACA；GAPDH前引物(5′-3′)TGCTGGTGCTGA-GTATGTCG，后引物(5′-3′)AGTTGGTGGTGCAGGATGC。

(四)酶聯免疫吸附測定法(Elisa)檢測血清Cyr61表達：根據試劑盒說明書進行操作，繪制標準曲線計算Cyr61濃度。

三、統計學分析

結 果

一、大鼠血清ALT、AST表達水平變化

在APAP處理后2 h，血清ALT水平開始升高(P<0.05)，2 h～12 h期間隨處理時間延長，血清ALT水平越來越高(P<0.05)，24 h時趨于平穩(12 h與24 h表達無差異，P>0.05)；血清AST變化水平規律與ALT一致。

二、大鼠血清Cyr61表達水平變化

在獲得Elisa數據后，繪制標準曲線，根據回歸方程y=227.12x+8.96(y值為濃度，x值為OD值，R2=0.998)計算Cyr61濃度水平。如表1所示，與對照組相比，APAP處理組大鼠血清Cyr61水平在1～8 h逐漸升高(P<0.05)，8 h和12 h的表達水平無差異(P>0.05)，24 h時Cyr61表達水平降低(P<0.05)；APAP+GSH治療組血清的Cyr61水平明顯低于APAP處理組(P<0.05)，且與APAP處理組一致，Cyr61水平升高于8 h和12 h趨于穩定(P<0.05，8 h與12 h相比無統計學差異，P>0.05)，24 h降低(P<0.05)。

表1 三組大鼠血清Cyr61表達水平變化(±s, pg/mL)

三、大鼠肝臟Cyr61 mRNA表達水平變化

如圖1所示，APAP處理組大鼠造模1～8 h的肝臟Cyr61 mRNA水平呈上升趨勢，8 h時到達峰值，12和24 h時表達水平下降，組間差異有統計學意義(P<0.05)；與APAP處理組相比，APAP+GSH治療組大鼠的Cyr61轉錄水平與APAP處理組相比明顯降低(P<0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)。

a表示在APAP處理組間，與1 h比較，P<0.05；b表示APAP處理組與APAP+GSH治療組比較，P<0.05。圖1 三組大鼠肝臟Cyr61 mRNA表達相對水平

討 論

在過去的幾十年里，APAP誘導的急性肝損傷在世界各國中較為常見[9]。臨床上通過測定ALT和AST水平以監測和評估APAP誘導的肝損傷情況，但這些指標缺乏特異性。為更好地進行評估患者預后，尋找更特異的急性肝損傷生物學標志物是目前的研究重點。

近年來人們對Cyr61的研究逐漸增多，目前已知其為細胞外基質交聯的血管調節因子。有研究通過建立大鼠腎臟急性缺血再灌注(I/R)模型檢測Cyr61表達量，發現Cyr61在腎損傷中的變化規律[10]。目前尚無關于Cyr61與急性肝損傷的研究數據，我們通過建立APAP誘導急性肝損傷模型，檢測Cyr61 mRNA發現其變化同樣具有規律性，在造模后1 h肝組織表達Cyr61水平升高，2～8 h逐漸升高至峰值，12～24 h時逐漸降低；APAP+GSH治療組Cyr61的表達明顯低于APAP處理組，變化規律與其一致。而在血清中，我們檢測到在造模后1 h，Cyr61表達水平升高，2～8 h逐漸升高至峰值，12 h趨于平穩，24 h時Cyr61水平降低；APAP+GSH組Cyr61水平顯著低于APAP處理組，且Cyr61變化規律與APAP處理組一致。以上結果提示我們，Cyr61在APAP所致急性肝損傷及治療后損傷減輕情況的評估有一定指導意義。另外，Cyr61在大鼠肝臟發生急性損傷后的表達水平變化均早于ALT及AST，提示Cyr61可能是針對APAP所致急性肝損傷更為敏感和特意的生物學指標，值得在臨床研究中進一步證實。