MicroRNA27a抑制肝星狀細胞脂質代謝分子機制的初步研究

徐梓馨 羅昕 羅聲政 徐銘益 林仁坤

非酒精性脂肪性肝病(nonalchoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂肪在肝臟異位沉積為特征的一組臨床病理綜合征[1-2]。近年隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變， NAFLD 的患病率不斷提高，但是對于NAFLD 發病機制的研究尚不完全清楚，治療選擇有限[3-5]。microRNA(miRNA)是一類高度保守的組織特異性小非蛋白質編碼RNA，在細胞生長、分化和死亡等過程中起重要作用，其表達失調會引起疾病[6-7]。miRNA已被證明在嚙齒動物和人類肝病中具有預后和預測價值[8-10]。文獻報道miR-27、miR141、miR-212-5p、miR-122、miR-34a和miR-16等在慢性肝病中發揮重要作用[12-16]。研究發現，miR-27參與調節脂肪細胞和巨噬細胞中的脂質代謝，并與動脈粥樣硬化的發生發展有關[17]。

研究表明，轉分化(或“激活”)的肝星狀細胞是分泌基質蛋白的成肌纖維細胞的主要細胞來源，是肝纖維化的主要驅動力[18]。本研究通過觀察過表達 miR -27a 之后肝星狀細胞脂質沉積變化和相關脂質代謝蛋白的表達水平，以及脂肪肝模型小鼠 miR -27a 表達水平和相關脂質代謝蛋白水平的變化，探討肝星狀細胞中 miR -27a 表達水平與肝脂肪變的關系。

資料與方法

一、材料與試劑

實驗小鼠購于中國科學院上海實驗動物中心，LX2細胞保存于上海市第一人民醫院臨床轉化院實驗室，DMEM培養基、胎牛血清購自美國 Hyclone公司、0.25%的胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ均購自上海曜登生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 脂質體轉染試劑盒、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑購 自 美 國 Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自日本 TaKaRa公司，SYBR GreenPCR 試劑盒購自美國 ApplideBiosystem公司，PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HE、天狼星紅染色試劑購于上海萌椏生物科技有限公司。

二、方法

(一)實驗動物 健康雄性C57BL/6小鼠10只，SPF級，約 4周齡，體質量 12～15 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，飼養于上海交通大學附屬第一人民醫院實驗動物中心，自由飲水，溫度濕度符合標準，實驗小鼠隨機分為普通飲食加CCL4組、高脂加CCL4組，每組各5只，均腹腔注射CCL4,分別給予普通飼料，高脂飼料喂養，喂養至8周處死，部分肝組織放于14% 甲醛溶液中，石蠟包埋組織學染色；同時留取少量組織存放于-80℃冰箱用于后續PCR。

(二)細胞培養 采用含10%FBS的DMEM培養基培養人星狀細胞，置于 37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中進行培養。加入 0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，并進行傳代。傳代時，將細胞懸液均勻地分配至細胞培養皿中，完全培養基補充至每皿 6 mL，繼續培養，根據需要收集細胞,用于PCR、油紅染色實驗。

(三)肝臟組織病理檢查 肝組織固定48 h后，常規脫水、透明和石蠟包埋。以4 μm厚度進行石蠟組織切片， HE和天狼猩紅染色，光學顯微鏡下檢測其病理程度并拍照。

(四)過表達 miR-27a的LX2細胞建立 取生長狀態良好的LX2細胞接種于6孔板中，每孔加入 2×105個細胞，當細胞融合度達到80%左右時，使用 LipofectamineTM2000轉染試劑盒進行轉染， 瞬時轉染按照說明書進行。設置空白對照組、過表達組(miR-27a)，轉染濃度為50 nmol/mL 的miR27a mimics，轉染48 h；

(五)qRT-PCR 法檢測 miR-27a、FAS、SCD1相對表達量 按照試劑說明書采用TRIzol法提取總RNA并純化, 利用 Nanodrop 系統測定 RNA 樣品的濃度和純度，檢測 260 nm 和 280 nm 下吸光度(A)值，判斷樣品純度是否符合實驗要求。測定RNA濃度。反轉錄合成cDNA后行RT-PCR。RT-PCR引物序列見表1。實驗過程中以U6 、β-actin分別作為miRNA-27a、FAS、SCD1 的內參對照, 進行標準化轉換得到各樣本的拷貝數(Ct 值), 樣品目的基因的相對表達率(Relative expression，RQ)采用 △△CT 方法計算，RQ=2-△△CT。每個樣品的內參基因和靶基因各設3個重復試驗。

表1 qRT-PCR相關引物序列

(七)油紅染色檢測脂質沉積程度 棄掉培養液，用PBS輕緩清洗3次，加入10%多聚甲醛固定30 min后，按照儲備液：稀釋液=5：2的比例配制染色液，配好后用慢速濾紙濾過，染色10 min，染液體積覆蓋住孔板即可，用60%異丙醇漂洗，除去多余染料，保持背景色干凈，復染12 s，封片，鏡檢。

三、統計學分析

正態分布的計量資料以均數±標準差表示，采用 SPSS16.0 統計軟件分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間采用方差分析，偏態分布時采用非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠肝組織病理檢查

HE染色結果顯示普通飲食加CCL4組肝小葉結構不完整，中央靜脈周圍肝細胞索排列紊亂，匯管區可見有炎性細胞浸潤,部分肝細胞點狀壞死。高脂加CCL4組肝組織可見肝小葉結構不完整，中央靜脈周圍肝細胞索明顯紊亂,匯管區肝細胞片狀壞死，同時可見中央靜脈周圍肝細胞脂肪變性，出現大量大小不等的脂滴泡。天狼星紅染色顯示，普通飲食加CCL4組和高脂加CCL4組均有纖維增生，可見明顯染色成紅色的纖維間隔，如圖1。

圖1 各組小鼠肝組織光鏡下表現 A、B：HE染色(×100)；C、D：天狼星紅染色結果(×100)

二、miR-27a在高脂加CCL4組小鼠肝組織中表達下降

在高脂加CCL4組小鼠肝組織中，miR-27a相對表達水平為(0.230±0.001,P=0.02)，普通飲食加CCL4組小鼠肝組織中miR-27a相對表達水平為(1.00±0.0021)，高脂加CCL4組miR-27a表達明顯下降，說明在CCL4誘導肝纖維化的情況下，高脂誘導肝臟脂肪變時miR-27a表達水平也會下降。

三、高脂加CCL4組小鼠肝臟組織中FAS、SCD1相關mRNA表達上升：

FAS、SCD1均為促進脂肪酸合成的關鍵酶。普通飲食加CCL4組FAS與SCD1分別為(1.00±0.016)、(1.00±0.032)，高脂加CCL4組小鼠肝組織中FAS、SCD1相關的mRNA表達量明顯增高，分別為(2.23±0.24)，P=0.0267，(1.98±0.17)，P=0.011；說明在高脂喂養的情況下，FAS、SCD1的表達可增強，提示脂肪酸合成增強。

四、PA刺激后LX2細胞中miR-27a表達下降

對照組miR-27a表達為(1.00±0.131), 200 μmol/L、400 μmol/L PA刺激LX2細胞后miR-27a 的相對表達量為分別為(0.333±0.003，P=0.0024)和(0.413±0.005，P=0.001)，PA刺激常用來誘導細胞脂肪變性，提示在脂肪變性的LX2細胞中miR-27a的表達可能受到抑制。

五、過表達miR-27a后LX2細胞脂質沉積減輕

空白對照組細胞輪廓稍變圓，細胞內可見散在紅色脂滴分布，位于細胞膜內側邊緣。在過表達miR-27a后48 h，LX2細胞內鮮見脂滴，胞內可見細胞核，邊緣清晰。如圖2。

圖2 空白對照組(A)和miRNA-27a過表達組(B)油紅染色(×200)

六、在過表達miR-27a后LX2細胞FAS、SCD1的mRNA表達下降

對照組FAS、SCD1相關mRNA表達量分別為(1.00±0.085)和(1.00±0.034) ，miR-27a過表達組中FAS、SCD1相關mRNA表達量分別為(0.21±0.001)和(0.35±0.005)，與對照組比較，差異有統計學意義(均P<0.05)，說明miR-27a過表達可能抑制FAS、SCD1的表達，FAS、SCD1均為促進脂肪酸合成的關鍵因素，提示miR-27a可能通過抑制下游靶基因FAS、SCD1抑制肝星狀細胞脂質代謝。

討 論

文獻報道，miR-27在肝臟脂質代謝紊亂時表達受到抑制[19]。Zhang等[20]發現在肝原代細胞中，miR-27a能通過抑制脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1 ，SCD1)調節肝臟脂質代謝從而減輕NAFLD。FAS、SCD1是高等動物內源性脂肪酸合成的重要的酶，其在肝臟中的表達水平與肝臟脂肪變性的程度相關[21-23]。肝星狀細胞的活化一直被認為是肝纖維化發生的啟動步驟[18]，但肝星狀細胞在脂肪肝發生發展過程的變化鮮見報道。本課題組前期實驗發現，在PA誘導脂肪變性的肝星狀細胞中miR-27a相對表達量出現顯著下降，說明肝星狀細胞脂肪變性時，miR-27a的表達也會受到抑制。同時檢測小鼠肝臟組織中miR-27a的相對表達量發現，相比較普食加CCL4組的小鼠，高脂加CCL4組小鼠miR-27a表達量也明顯下降， miR-27a的表達在脂肪變性的肝細胞中受到抑制[21]。本實驗結果表明在肝臟脂肪變性時，miR-27a的表達不僅會在肝細胞中受抑制，肝星狀細胞也會出現同樣的現象。將肝星狀細胞過表達miR-27a，油紅檢測脂質沉積發現，相比對照組，過表達組肝星狀細胞中脂質沉積明顯減輕，說明在肝星狀細胞中，miR-27a可能是通過抑制脂質沉積來減緩脂肪變性的進程；同時PCR結果顯示，過表達miR-27a后的肝星狀細胞中促脂肪酸合成因子FAS、SCD1的mRNA表達量均顯著下降，而高脂加CCL4組小鼠肝組織FAS、SCD1相關mRNA表達量顯著高于普食加CCL4組小鼠的表達水平，提示在肝星狀細胞中，miR-27a可能是通過抑制這兩種酶的表達導致脂肪酸合成減少進而抑制脂質沉積，逆轉脂肪變的發生發展。

本研究中結果表明，miR-27a可抑制肝星狀細胞的脂質代謝，這一作用的發揮可能是通過促進FAS、SCD1在脂質代謝過程的作用，但是進一步的相關機制尚未清楚。探討肝星狀細胞中 miR -27a 表達水平與肝脂肪變的關系，可為研究肝脂肪變提供一個不同的思路。