NF-κB與Caspase-9在胃癌組織中的表達及臨床意義

王 敏，程善光，季萬勝

(濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊 261031)

核因子-κB(NF-κB)是一種具有多向性轉錄調節功能的蛋白，在許多惡性腫瘤中均有高表達［1，2］，與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和轉移等密切相關。Caspase-9是一種促凋亡因子，是內源性細胞凋亡傳導通路中最重要的凋亡啟動因子，其活化能啟動級聯激活反應而促進細胞凋亡［3］。2010年1月～2010年11月，我們采用免疫組化法檢測了NF-κB與Caspase-9在胃癌組織中的表達，并分析其與臨床病理特征的關系，旨在探討其在胃癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 同期行手術切除并經病理證實的胃癌組織標本68份(胃癌組)，患者男48例，女20例，年齡20～79歲，中位年齡59.5歲。根據WHO分類標準，低分化/Ⅲ級胃癌23例，高、中分化/Ⅰ、Ⅱ級胃癌45例;有淋巴結轉移38例，有漿膜浸潤40例。患者術前均未行化療、放療和免疫治療。另取距離癌灶5 cm以上癌周正常組織作為癌旁組。

1.2 NF-κB、Caspase-9表達檢測 所有組織標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，制備4 μm厚連續切片，采用免疫組化法檢測NF-κB和Caspase-9表達。兔抗人Caspase-9抗體、兔抗人NF-κBp65抗體均購于武漢博士德公司，PV-9000二步法所用免疫組化檢測試劑及DAB顯色試劑盒購于北京中杉生物科技有限公司，嚴格按說明書操作，用已知的陽性片做陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定:NF-κB、Caspase-9陽性表達為細胞質和/或胞核染成棕褐色或棕黃色。隨機抽取有代表性的10個連續的高倍視野(×400倍)，每個視野計數100個細胞，均值為該切片的積分值。根據染色強度及陽性細胞比例進行綜合評分。染色強度評分:無色為0分，淺黃為1分，棕黃為2分，棕褐為3分;陽性細胞百分比評分:＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積≤1分為陰性，≥2分者為陽性［4］。分析 NF-κB、Caspase-9 表達與胃癌臨床病理特征的關系及二者表達的相關性。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件包進行數據處理，采用 Fisher確切概率法和 χ2檢驗及Spearman等級相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB及 Caspase-9表達 胃癌組及癌旁組NF-κB 陽性率分別為 63.2%(43/68)、33.3%(23/68);Caspase-9陽性率分別為 36.8%(25/68)、80.9%(55/68)，P 均 ＜0.05。

2.2 NF-κB和Caspase-9表達與胃癌臨床病理特征的關系 見表1。

表1 NF-κB和Caspase-9表達與胃癌臨床病理參數的關系

2.3 NF-κB、Caspase-9在胃癌組織中表達的相關性胃癌組NF-κB表達陽性的43例組織中Caspase-9蛋白表達陽性11例，25例陰性表達NF-κB的組織中14例Caspase-9蛋白表達陽性，經Spearman等級相關分析，NF-κB和Caspase-9的表達呈負相關(r=－0.304，P=0.025)。

3 討論

NF-κB是調節細胞基因轉錄的關鍵因子，參與多種凋亡相關基因的轉錄調控，在腫瘤的發展過程中發揮重要作用［5］。其激活最常見的形式為p50和p65組成的二聚體，在非激活條件下，NF-κB與抑制因子IκB相結合而處于無活性狀態。當細胞受到細胞因子、腫瘤壞死因子(TNF)等多種刺激時，IκB發生磷酸化和泛素化并隨后降解，NF-κB被激活并與IκB分離，活化的NF-κB從胞質轉移至胞核，定位于細胞核而不能返回胞質，與靶基因上啟動子或增強子的κB基因序列發生特異性結合，調控一系列腫瘤相關基因的轉錄表達，抑制腫瘤細胞凋亡、促進血管生成與局部浸潤［6］。通常認為，NF-κB在癌癥的早期事件中通過刺激惡性細胞生長參與細胞惡性轉化而促進癌癥的發生;在癌癥晚期發展中，NF-κB作為調節因子也發揮一定作用，如NF-κB可上調 COX-2、MMP-7表達，促進腫瘤血管生成和轉移［7］。Sasaki等［8］對胃癌組織及癌旁組織進行免疫組化和RT-PCR分析，發現NF-κB的活性與淋巴結轉移、浸潤深度、腹膜轉移、腫瘤體積等臨床病理特點有關，與胃癌患者的存活時間呈負相關。本研究結果表明，NF-κB在胃癌組織中的表達率顯著高于癌旁組織，其表達與胃癌的組織學分型、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關，即隨著分化減低、浸潤深度的增加體積，淋巴結轉移，NF-κB的表達明顯升高，此與Sasaki等報道的結果相符，說明NF-κB能夠促進胃癌的發生、發展、侵襲及轉移，并可以對胃癌的預后進行預測。

Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族，是執行細胞凋亡的主要酶類，通常情況下以無活性的酶原形式存在于細胞中，在細胞線粒體依賴的凋亡傳導途徑中，Caspase-9屬于啟動型Caspase，位于細胞凋亡傳導通路的上游，當凋亡起始信號作用于線粒體后，引起線粒體釋放細胞色素C，與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)結合并使其構象改變形成活性復合體，后者與Caspase-9結合并誘導其發生自身活化，活化后又能激活下游的Caspase因子，啟動細胞凋亡級聯反應，從而導致細胞凋亡。由于Caspase可以自我活化并能夠相互激活，因此凋亡過程一旦觸發，即呈級聯放大效應。Park等［9］研究 MMC介導的SUN-16人胃癌細胞株凋亡時發現，Caspase-9在腫瘤細胞的凋亡過程中發揮了重要作用。Caspase-9蛋白低表達時細胞凋亡受到抑制的機制可能是Caspase-9蛋白表達下降，其激活下游Caspase因子的能力降低，從而使細胞凋亡減少，細胞凋亡和增殖平衡被打破，胃癌則可能發生。本研究結果表明，Caspase-9在胃癌組織中的表達率明顯低于癌旁組，且分化程度越差其表達率越低，但與浸潤深度和有無淋巴結轉移無明顯關系。表明Caspase-9表達與胃癌的惡性程度有關，Caspase-9是正常分化細胞所具有的，正常細胞向癌細胞轉化的過程中易失去某些表型，因而我們認為Caspase-9隨著分化降低而表達減少，是腫瘤異常分化的結果。

本研究還發現NF-κB和Caspase-9在胃癌組織中表達呈負相關。說明NF-κB能夠通過某種途徑抑制Caspase 9的表達，從而抑制細胞凋亡。可以認為胃癌細胞在NF-κB的作用下增殖、分化乃至轉移，在此過程中，Caspase-9作為影響細胞凋亡的過程因子，也起著不可或缺的作用。

總之，胃癌組織中存在 NF-κB高表達及Caspase-9低表達，且 NF-κB對 Caspase-9具有負性調節作用，可以進一步抑制細胞凋亡，共同促進胃癌的發生發展。進一步深入研究兩種因子與胃癌的關系，可為揭示胃癌的發病機制提供新的思路。

［1］Sethi G，Sung B，Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B activation:from bench to bed side［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2008，233(1):21-31.

［2］Ng CS，Novick AC，Tannenbaum CS，et al.Mechanisms of immune evasion by renal cell carcinoma:tumor-induced T-lymphocyte apoptosis and NF kappaB suppression［J］.Urology，2002，59(1):9-14.

［3］Green DR，Reed JC，Mitochondria and apoptosis［J］.Science，1998，281(5381):1309-1312.

［4］Romieu-Mourez R，Landesman-Bollag E，Seldin DC，et al.Roles IKK kinases and protein kinase CK2 in activation of nuclear factorκB in breast cancer［J］.Cancer Res，2001，61(9):3810-3818.

［5］Loercher A，Lee TL，Ricker JL，et al.Nuclear factor-kappa B is an important modulator of the altered gene expression profile and malignant phenotype in squamous cell carcinoma［J］.Cancer Res，2004，64(18):6511-6523.

［6］Bharti AC，Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B and cancer:its role in prevention and therapy［J］.Biochem Pharmacol，2002，64(5-6):883-888.

［7］Yu HG，Zhong X，Yang YN.Increased expression of nuelear factorkappaB is correlated with tumor angiogenesis in human colorectal cancer［J］.int J Colorectal Dis，2004，19(l):18-22.

［8］Sasaki N，Morisaki T，Hashizume K，et al.Nuclear factor-kappa B p65(RelA)translation factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue［J］.Clin Cancer Res，2001，7(12):4136-4142.

［9］Park JC，Park MJ，Hwang CS，et al.Mitomycin C induces apoptosis in a caspases-dependent and Fas/CD95-independent manner in human gastric adenocarcinoma cells［J］.Cancer Lett，2000，158(2):125-132.