p53基因多態性與鼻咽癌遺傳易感性的關系

樓建軍 朱小東 曲 頌 潘聞燕 李小宇 (廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧 530021)

鼻咽癌(NPC)是我國常見的惡性腫瘤之一，在頭頸部惡性腫瘤中占首位。據統計:世界上大多數地區NPC的發病率在1/10萬以下，而我國南方某些地區高達33/10萬(男)、15.60/10萬(女)〔1，2〕。p53基因與 NPC 發生的關系引起了研究者的注意。本研究收集了臨床資料完整的NPC病人的血液標本和對照人群的血液標本，研究p53基因的單核苷酸多態性(SNP)與NPC發生的關系，為NPC基礎研究和臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2010年3月至2011年9月在我院放療科住院的NPC患者(NPC組)200例。男女各100例，年齡25～70〔平均(47±19)〕歲。所有患者均經病理學證實，住院前均未接受過化學治療、放射治療或生物治療等干預措施。主要臨床表現:頸部包塊84例;鼻部癥狀:血涕70例，鼻堵42例，鼻出血19例;耳部癥狀56例;頭痛43例;顱神經癥狀48例。對照組200例，為同期身體健康的志愿獻血者，男女各100例，年齡21～50〔平均(38±12)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 引物設計 由Primer 5.0引物設計軟件設計，上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游5′－GAGGAGGGACGGTTGGTT－3′;下游 5′－GGTGAGTGAGGAGGTGCTG－3′。

1.2.3 PCR 擴增 25 μl反應體系含2 ×PCR TaqMix 12.5 μl，滅菌水 9.5 μl，DNA 模板 1.0 μl，上游引物 1.0 μl，下游引物1.0 μl。PCR反應采用型號 PXE0.2、Thermo公司的 PCR儀。95℃預變性，5 min;進入循環:變性95℃，30 s;退火61℃，30 s;延伸72℃，30 s;共30個循環。終末延伸72℃，8 min。取PCR產物8 μl在含溴乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后將凝膠置于凝膠成像系統(Alphalmager，美國)觀察結果。

1.2.4 PCR產物純化(試劑盒法) 試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2.5 酶切反應體系 體系為10 μl，其中 PCR純化產物5.0 μl，10 × 限制性內切酶緩沖液 1.0 μl，AciI 內切酶 0.3 μl，滅菌雙蒸水 3.7 μl，37℃溫育 16 h。

1.2.6 測序分析 隨機挑選部分PCR純化產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，以檢驗分型是否準確。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，組間人群基因進行Hardy－Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗，計數資料以百分率表示，進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 擴增出的PCR產物片段長為180 bp，見圖1。

2.2 酶切結果分析 p53基因rs117562731位點野生純合子基因型為CC型，電泳圖上見115 bp和65 bp的兩條帶;突變純合子基因型TT型，電泳圖上見180 bp一條帶;雜合子基因型為CT型，電泳圖上見180 bp、115 bp和65 bp的三條帶。見圖2。

2.3 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢測 將兩組的等位基因頻率進行Hardy－Weinberg遺傳平衡吻合度檢測，各基因型頻率與期望值吻合度較好，基因型分布符合Hardy－Weinberg遺傳平衡(P＞0.05)。

2.4 p53基因與NPC的相關性分析 在NPC組攜帶CC、CT及TT基因型頻率分別為80.0%、17.0%和3.0%，在對照組中分別為93.0%、5.5%和1.5%。CT+TT基因型發生NPC的風險是CC基因型的3.321倍(P=0.000，OR=3.321，95%CI:1.744～6.326)，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.5 NPC組臨床特征與p53基因 rs117562731位點多態性比較 根據臨床特征進一步分析，結果提示各基因型與T分期、N分期及M分期無顯著相關性(P＞0.05)。見表2。

圖1 rs117562731位點PCR擴增目的片段為180 bp

表2 NPC組不同臨床分型與p53 rs117562731多態性的關聯性分析〔n(%)〕

圖2 rs117562731位點酶切圖

表1 p53 rs117562731基因型與NPC風險的關系〔n(%)，n=200〕

3 討論

p53基因編碼一種分子量為53 000的磷酸化蛋白質，所以稱為p53基因。正常p53基因的生物學功能好似“基因組衛士”，在G1期檢測DNA的損傷點，監視細胞基因組的完整性。如果DNA有損傷，p53基因阻止DNA復制，使損傷的DNA得以修復;若修復成功，DNA繼續復制;如果修復失敗，p53基因則引發凋亡〔3〕，使損傷的DNA不能繼續復制。p53基因突變可增加正常細胞對突變劑的敏感性，結果導致正常細胞癌變概率增加，使腫瘤的發病率增加。p53基因結構和功能改變與多種腫瘤的發生發展關系密切〔4〕。p53基因的點突變、變異和多態性與NPC的發病相關性研究較少，本研究結果表明CT+TT基因型與CC基因型相比，其患NPC的風險顯著增加。揭示本位點與NPC的易感性有明顯相關，說明此位點是NPC發生的危險因素。而且各基因型與T、N及M分期無顯著相關性。

超過50%的人類腫瘤中有p53基因功能失活及突變，以結腸癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌的突變最為常見〔5，6〕。Shirai等〔7〕研究發現p53基因多態性與胃癌的發生有關聯，也與胃癌的侵襲和進展有顯著的相關性。Phang等〔8〕研究表明p53基因多態性與多種癌癥的風險有顯著的相關性。Saeki等〔9〕也證實p53基因多態性與食管鱗狀細胞癌的發生有關聯。Liu等〔10〕發現p53基因相關位點的SNP增加了患乳腺癌的風險。Sun等〔11〕研究發現p53基因與前列腺癌的發生與進展有顯著的相關性。p53基因功能失活有多種方式:①p53基因的SNP突變:其中最為主要是點突變引起的錯義突變，其比例約占80%左右。②被DNA腫瘤病毒蛋白失活。③被Mdm蛋白抑制。④p53基因的誤位。本實驗研究主要針對基因點突變方面進行研究，結果顯示選取的p53 rs117562731 SNP位點攜帶的變異等位基因在NPC組與對照組之間有顯著性差異，說明此位點的突變有可能是導致NPC發生和發展的一個重要因素，但其確切機制仍不清楚。

1 殷蔚伯，余子豪，徐國鎮，等.腫瘤放射治療學〔M〕.第4版.北京:中國協和醫科大學出版社，2008:443－9.

2 朱廣迎.放射腫瘤學〔M〕.第2版.北京:科學技術文獻出版社，2007:231－2.

3 鄭 杰.腫瘤的細胞和分子生物學〔M〕.第2版.上海:上海科學技術出版社，2011:104－8.

4 Knudson AG.Two genetic hits(more or less)to cancer〔J〕.Nat Rev Cancer，2001;1(2):157－62.

5 Selivanova G.Therapeutic targeting of p53 by small molecules〔J〕.Semin Cancer Biol，2010;20(1):46－56.

6 Shangary S，Wang S.Small－molecule inhibitors of the MDM2－p53 proteinprotein interaction to reactivate p53 function:a novel approach for cancer therapy〔J〕.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2009;49(1):223－41.

7 Shirai O，Ohmiya N，Taguchi A，et al.P53，p21，and p73 gene polymorphisms in gastric carcinoma〔J〕.Hepatogastroenterology，2010;57(104):1595－601.

8 Phang BH，Chua HW，Li H，et al.Characterization of novel and uncharacterized p53 SNPs in the Chinese population－－intron 2 SNP co－segregates with the common codon 72 polymorphism〔J〕.PLoS One，2011;6(1):e15320.

9 Saeki H，Kitao H，Yoshinaga K，et al.Copy－neutral loss of heterozygosity at the p53 locus in carcinogenesis of esophageal squamous cell carcinomas associated with p53 mutations〔J〕.Clin Cancer Res，2011;17(7):1731－40.

10 Liu J，Desai KV，Li Y，et al.Germ－line variation at a functional p53 binding site increases susceptibility to breast cancer development〔J〕.Hugo J，2009;3(1－4):31－40.

11 Sun T，Lee GS，Oh WK，et al.Single－nucleotide polymorphisms in p53 pathway and aggressiveness of prostate cancer in a Caucasian population〔J〕.Clin Cancer Res，2010;16(21):5244－51.