導(dǎo)痰湯對(duì)頸動(dòng)脈硬化家兔內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1及p53表達(dá)的影響

陳文強(qiáng) 黃小波 李宗信 王 芬 王寧群 (首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 00053)

頸動(dòng)脈硬化在腦梗死的發(fā)生中發(fā)揮重要作用〔1〕。頸動(dòng)脈硬化過程中，細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起了極其重要的作用〔2〕，而ICAM-1的表達(dá)則與p53的調(diào)控密切相關(guān)〔3〕。導(dǎo)痰湯作為臨床常用化痰名方，能夠燥濕化痰，行氣開郁。目前臨床上經(jīng)常使用導(dǎo)痰湯進(jìn)行頭暈治療，并取得了較好的療效。本課題組在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)痰湯能夠有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)〔4〕。但是，對(duì)于導(dǎo)痰湯治療動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究的報(bào)道較少，妨礙了其臨床療效的驗(yàn)證和進(jìn)一步推廣。因此，我們將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究導(dǎo)痰湯是否能通過干預(yù)ICAM-1和p53通路的途徑而用于治療頸動(dòng)脈粥樣硬化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性新西蘭白兔，體重2～2.2 kg，購自北京開源兔業(yè)養(yǎng)殖場(SCXK(京)2006-0005)。

1.2 制備導(dǎo)痰湯 按照《濟(jì)生方》中導(dǎo)痰湯的配伍比例:半夏9 g，南星 3 g，茯苓 3 g，炒枳實(shí)3 g，橘紅3 g，甘草2 g，生姜3 g。參照《中國藥典》(2000年版)，蒸餾水泡2 h，常法煎煮2次，每次40 min，濾出，60℃恒溫箱內(nèi)24 h，水浴蒸發(fā)濃縮至100%，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 新西蘭白兔造模前以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，在穩(wěn)定其血脂水平和代謝狀況后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(A組，5只)、模型組(B組，5只)、導(dǎo)痰湯治療組(C組，15只，分為大、中、小劑量組，每組5只，使用中藥灌胃，)共3組。A組給予基礎(chǔ)飼料喂飼;B、C組予以高脂飼料喂飼。高脂飼料配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù):2%膽固醇+2%豬油+96%基礎(chǔ)飼料)。B、C組動(dòng)物在喂飼1 w后實(shí)施頸動(dòng)脈內(nèi)膜空氣干燥術(shù)，術(shù)后C組家兔喂飼導(dǎo)痰湯4 w，分別按照10，8，6 ml/kg，使用導(dǎo)痰湯灌胃，每日給藥1次。所有動(dòng)物均單籠喂飼，飲水不限，每日每只進(jìn)食150 g飼料。

1.4 頸總動(dòng)脈內(nèi)膜空氣干燥術(shù) 10%的水合氯醛(劑量為5 ml/kg)灌腸后，頸部脫毛消毒;頸部正中縱行切口，鈍性分離，暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，長度約2 cm;用動(dòng)脈夾臨時(shí)夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端后用皮試針頭于近心端夾閉外近刺入管腔，再在遠(yuǎn)心端刺破頸總動(dòng)脈;將抽有生理鹽水的注射器連接于皮試針頭，用生理鹽水灌洗血管腔，然后將醫(yī)用氮?dú)膺B接于皮試針頭向夾閉段的頸總動(dòng)脈行空氣干燥術(shù)，以120 ml/min進(jìn)行干燥，時(shí)間10 min;干燥術(shù)后拔出皮試針頭，松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)右側(cè)頸總動(dòng)脈的血流，用棉簽輕壓傷口，待完全止血后去掉棉簽，輕壓2 min;待頸總動(dòng)脈完全止血且血流通暢后用慶大霉素局部抗感染，并縫合皮膚。

1.5 HE染色觀察頸動(dòng)脈病理改變 每組每只家兔所取的右側(cè)頸動(dòng)脈截取遠(yuǎn)端1 cm，中性緩沖甲醛(pH7.4)固定24 h后取材脫水，石蠟包埋固定，4 μm厚連續(xù)切片，60℃ ～62℃烘箱(DHG-9140A型電熱恒溫箱)烤片2 h后行HE染色。每組每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取1張切片，觀察病理改變。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 每組每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5張石蠟切片，應(yīng)用免疫組化SABC法(免疫組化PV 9000試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，參照試劑盒說明書操作。陽性著色為內(nèi)皮表面棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物沉積，呈胞漿染色，以PBS代替一抗作空白對(duì)照組。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野(400倍)，計(jì)算機(jī)圖像掃描定量分析平均光密度(OD)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較使用單因素方差分析，p53與ICAM-1相關(guān)性使用相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 頸動(dòng)脈HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜完整，中膜為梭形平滑肌細(xì)胞。模型組有粥樣斑塊形成，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下有大量泡沫細(xì)胞堆積;導(dǎo)痰湯干預(yù)組內(nèi)膜也有輕度的增生，內(nèi)膜下有少量的泡沫細(xì)胞形成，程度輕于模型組(圖1)，表明頸動(dòng)脈粥樣硬化模型制作成功，導(dǎo)痰湯對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化具有一定的干預(yù)作用。

2.2 頸動(dòng)脈免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 正常對(duì)照組血管壁有少量ICAM-1和p53陽性表達(dá)細(xì)胞。模型組血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中有ICAM-1和 p53強(qiáng)陽性表達(dá)，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。導(dǎo)痰湯治療組細(xì)胞內(nèi)ICAM-1和p53陽性表達(dá)顯著低于模型組(表1，圖 1，P＜0.01)，且大劑量組的導(dǎo)痰湯對(duì)ICAM-1和p53的抑制均顯著強(qiáng)于小劑量組(P＜0.01)。

2.3 p53與ICAM-1相關(guān)分析 直線相關(guān)分析結(jié)果表明，p53與ICAM-1水平呈顯著正相關(guān)(r=0.809，P＜0.01)。

表1 導(dǎo)痰湯對(duì)頸動(dòng)脈硬化家兔ICAM-1和p53表達(dá)的影響(±s，n=5)

表1 導(dǎo)痰湯對(duì)頸動(dòng)脈硬化家兔ICAM-1和p53表達(dá)的影響(±s，n=5)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;與小劑量組比較:3)P＜0.05

組別ICAM-1 p53對(duì)照組0.037±0.005 0.082±0.015模型組 0.200±0.0351) 0.219±0.0651)導(dǎo)痰湯干預(yù)組小劑量組 0.166±0.0432) 0.179±0.048中劑量組 0.104±0.0112)3) 0.135±0.0222)大劑量組 0.098±0.0102)3) 0.123±0.0082)3)F值 31.328 9.502 P值 ＜0.01 ＜0.01

圖1 各組家兔ICAM-1和p53表達(dá)的影響(×400)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的病因尚未完全闡明，流行病學(xué)調(diào)查顯示其主要危險(xiǎn)因素與年齡、性別、高脂血癥、高血壓、吸煙、糖尿病等有關(guān)。目前普遍認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是由于致傷因素和血管反應(yīng)之間復(fù)雜的相互作用的結(jié)果〔5〕。

ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，是內(nèi)皮細(xì)胞活化標(biāo)志之一，在中性粒細(xì)胞遷移和內(nèi)皮細(xì)胞黏附致動(dòng)脈硬化過程中起重要作用〔6〕。單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮黏附并向內(nèi)皮下遷移和泡沫化，是動(dòng)脈粥樣硬化早期的病理過程〔7〕。ICAM-1幾乎參與了單核細(xì)胞黏附和遷移轉(zhuǎn)化的全過程，促進(jìn)和加速了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，與動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系〔8〕。在頸動(dòng)脈粥樣硬化等老年性疾病發(fā)病中，ICAM-1的表達(dá)可以在細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)環(huán)節(jié)上受到調(diào)控，其中p53表達(dá)異常可以直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1過表達(dá)〔9〕。由于細(xì)胞衰老是生物衰老的基本單位，并參與生物體衰老的整體進(jìn)程，也是人類頸動(dòng)脈粥樣硬化等老年病發(fā)病的共同基礎(chǔ)，而p53抑癌基因是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵效應(yīng)物，作為誘發(fā)人類細(xì)胞衰老刺激信號(hào)的重要誘導(dǎo)途徑，p53通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)DNA修復(fù)而成為細(xì)胞衰老遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)，并在頸動(dòng)脈硬化等衰老相關(guān)疾病中扮演了重要角色〔10〕。導(dǎo)痰湯可以有效抑制頸動(dòng)脈硬化過程中內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和p53的表達(dá)，表明導(dǎo)痰湯可能通過抑制p53這一途徑而調(diào)控ICAM-1的表達(dá)。這也可能是臨床上導(dǎo)痰湯可以治療動(dòng)脈硬化的一個(gè)內(nèi)在機(jī)制。

中醫(yī)經(jīng)典文獻(xiàn)中沒有動(dòng)脈粥樣硬化的記載，但根據(jù)其典型臨床表現(xiàn)應(yīng)屬于“眩暈”、“頭痛”等范疇。認(rèn)為系水谷精微由清化濁，變生痰濁，留滯血脈之中，凝聚成塊，如《醫(yī)學(xué)正傳》云:“津液稠黏，為痰為飲，積久滲入脈中，血為之濁”。另一方面，痰借血體，血借痰凝，痰瘀互結(jié)，凝于血脈，日久膠結(jié)不解，如《血證論》中云:“血積既久，亦能化為痰水”。因此，痰濁內(nèi)阻是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要病理基礎(chǔ)和致病因素〔11〕。臨床上則根據(jù)“無痰不作眩”等病機(jī)理論，將化痰法在動(dòng)脈粥樣硬化治療中加以運(yùn)用，取得了一定的療效。導(dǎo)痰湯作為臨床常用化痰名方，能夠燥濕化痰，行氣開郁。目前臨床上經(jīng)常使用導(dǎo)痰湯進(jìn)行降脂治療，并取得了較好的療效〔12，13〕。導(dǎo)痰湯中的主要成分南星、枳實(shí)、半夏、陳皮具有抗氧化、抗凝、降血脂等作用〔14，15〕，對(duì)動(dòng)脈硬化具有較好的治療作用。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，所以具體的作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。但現(xiàn)有研究表明，半夏和陳皮作為導(dǎo)痰湯中的主藥，兩者的主要成分分別是β-谷甾醇和陳皮苷，而這兩者均能抑制黃嘌呤氧化酶/次黃嘌呤體系中產(chǎn)生的超氧陰離子，其清除自由基能力在一定濃度范圍隨著藥物濃度的增大而增強(qiáng)，且β谷甾醇和陳皮苷具有明顯的協(xié)同作用〔16〕。由于β谷甾醇和陳皮苷是良好的抗氧化劑，能較好地清除自由基，而自由基與p53表達(dá)密切密切相關(guān)，并與衰老、炎性反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化等有關(guān)〔17〕;而且β-谷甾醇和陳皮苷均有較好的抗炎性反應(yīng)的作用〔18，19〕。

本結(jié)果說明隨著導(dǎo)痰湯濃度的增加，其藥效呈劑量依賴性。但值得注意的是，導(dǎo)痰湯中的主要成分半夏和南星均有一定的毒性。其中，半夏全株有毒，塊莖毒性較大，臨床上常使用的法半夏，經(jīng)過炮制毒性較小，但過量服用也可能對(duì)口腔、喉頭、消化道黏膜的強(qiáng)烈刺激;而大劑量使用南星則可導(dǎo)致呼吸道平滑肌水腫。因此，在追求提高臨床療效的同時(shí)，需要在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，合理配伍和炮制，注意降低中藥的不良反應(yīng)。

另外，ICAM-1分布于細(xì)胞表面和細(xì)胞間基質(zhì)，在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，以受體-配體形式發(fā)揮作用，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間，細(xì)胞與基質(zhì)間或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞間的黏附，參與細(xì)胞的信號(hào)傳遞與活化，炎性反應(yīng)等一系列重要生理和病理過程。這與痰性黏滯，易阻礙氣機(jī)，流竄周身的特性有一定的相似性。而以燥濕化痰為主要功用的導(dǎo)痰湯可有效抑制ICAM-1在體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。

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