亞砷酸鈉抑制血小板源性生長(zhǎng)因子受體β介導(dǎo)的細(xì)胞遷移及其機(jī)制

李 晶 鄢春亭 (吉化總醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 吉林 132021)

砷中毒可以導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等，嚴(yán)重者導(dǎo)致腫瘤，這些疾病的發(fā)生都是以血管內(nèi)皮損傷為基礎(chǔ)。損傷后機(jī)體的自我修復(fù)主要包括兩個(gè)方面:損傷部位周圍正常細(xì)胞的增殖和遠(yuǎn)處正常細(xì)胞的遷移。血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)與其受體(PDGFR)結(jié)合后主要參與血管壁細(xì)胞的發(fā)育，具有促進(jìn)外膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用，在血管形成后期發(fā)揮重要作用。間質(zhì)溶解素1(又稱為 MMP3)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的重要成員，有著廣泛的分解底物，包括蛋白聚糖、纖維結(jié)合蛋白、層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等。除此之外，MMP3可以增強(qiáng)其MMPs的活性〔1～3〕。而基質(zhì)的降解是細(xì)胞發(fā)生遷移的基礎(chǔ)。本課題組利用前期建立的穩(wěn)定表達(dá)PDGFRβ的豬動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAE)細(xì)胞系〔4〕，進(jìn)一步研究砷作用激活PDGFRβ通路時(shí)，MMP3基因表達(dá)的情況，為地砷病相關(guān)機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 PAE細(xì)胞，PDGFB鏈純合二聚體(PDGFBB)，人 PDGFRβ 表達(dá)質(zhì)粒(PDGFRβ/pcDNA3.0)，空載質(zhì)粒(pcDNA3.0)為瑞典Uppsala大學(xué)Heuchel和Heldin博士惠贈(zèng)。亞砷酸鈉(NaAsO2)購(gòu)于Sigma公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司，Lipofectamine 2000 和 RNA 提取試劑(Trizol－Reagent)購(gòu)自Invitrogen，RNase free DNase I 購(gòu)自 Promega，RT－PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa，PCR Marker、瓊脂糖均為Promega公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生物工程合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基中(含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)，置于5%CO2、飽和濕度、37℃條件下培養(yǎng)。指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×105/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，分別用人PDGFRβ表達(dá)載體(PDGFRβ/pCDNA3.0)及其空載(pCDNA3.0)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染應(yīng)用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000介導(dǎo)的方法，按照廠家產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取及RT－PCR檢測(cè)人PDGFRβ 應(yīng)用Trizol Reagent提取細(xì)胞總RNA，用RNase free DNase I對(duì)所獲樣品進(jìn)行處理，除去可能污染的DNA分子。應(yīng)用RT試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件:30℃、10 min，42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min;PCR 以得到的 cDNA 為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)總體系50 μl，取 RT反應(yīng)產(chǎn)物10 μl加入 PCR 反應(yīng)液(TaKaRa)40 μl中。人 PDGFRβ引物庫(kù) ID為 NM_002609，上游引物序列 5′－TGATGCCGAGGAACTATTCATCT－3′;下游引物序列 5′－TTTCTTCTCGTGCAGTGTCAC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為103 bp。反應(yīng)條件:94℃、2 min，94℃變性 15 s，53℃退火，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃、5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化乙啶)，拍照鑒定。用Pharmacia Image Master凝膠成像儀觀察分析基因表達(dá)的變化，結(jié)果用灰度值表示。

1.2.3 細(xì)胞損傷24 h完全修復(fù)所需PDGFBB最低濃度的測(cè)定 細(xì)胞按1×105/ml密度培養(yǎng)于24孔板中，待細(xì)胞完全匯合后，用200 μl槍頭制造劃痕，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去游離細(xì)胞后加入不同濃度PDGFBB，無(wú)血清培養(yǎng)24 h后于共聚焦顯微鏡下觀察劃痕的修復(fù)(遷移)，測(cè)量劃痕寬度。

1.2.4 NaAsO2對(duì)細(xì)胞遷移抑制率的檢測(cè) 細(xì)胞按5×105/ml密度培養(yǎng)于24孔板中，24 h后，用200 μl槍頭制造劃痕，PBS洗去游離細(xì)胞后，每孔加入1 ml用無(wú)血清的F12(含10 μg/L PDGFBB)配制好的不同濃度(0、2.5、5、10、20 μmol/L)NaAsO2溶液，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞遷移抑制率，微分干涉(DIC)拍照。抑制率公式:(孵育后的細(xì)胞劃痕寬度/孵育前的細(xì)胞劃痕寬度)×100%。

1.2.5 細(xì)胞總RNA提取及RT－PCR檢測(cè)MMP3 mRNA表達(dá)指數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×105/ml密度培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合 80%時(shí)，加入 F12(含10 ng/L PDGFBB)配制的NaAsO2，最終濃度分別為0、5、20 mol/L，每個(gè)組別各設(shè)三組平行樣，用于RNA的提取。應(yīng)用Trizol Reagent提取細(xì)胞總RNA

(按說(shuō)明書提取)，用RNase free DNase I對(duì)所獲樣品進(jìn)行處理，除去可能污染的DNA分子。應(yīng)用RT試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，反應(yīng)條件:42℃、60 min，70℃、15 min，4℃、5 min;以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)總體系50 μl，取RT反應(yīng)產(chǎn)物10 μl加入 PCR反應(yīng)液(TaKaRa)40 μl中。因本實(shí)驗(yàn)研究的 PAE細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) PDGFRβ，所以本實(shí)驗(yàn)把PDGFRβ定為內(nèi)參基因。MMP3:上游引物 5′－ACGGACCTCCCCCAGCTTCC－3′;下游引物 5′－GGATCACATGTGGCCGGCGT－3′擴(kuò)增產(chǎn)物為 88 bp。反應(yīng)條件:94℃、2 min，94℃、15 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后 72℃、5 min。PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化乙啶)，拍照鑒定。用Pharmacia Image Master凝膠成像儀觀察分析基因表達(dá)的變化，結(jié)果用灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR檢測(cè)人PDGFRβ在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá) 外源人PDGFRβ mRNA只在其表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行跟蹤檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDGFRβ在該細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定高水平表達(dá)，而在未轉(zhuǎn)染及空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均未見(jiàn)表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 PDGFRβ在各組細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 細(xì)胞損傷24 h完全修復(fù)所需PDGFBB最低濃度的測(cè)定未加入PDGFBB的對(duì)照組劃痕寬度與培養(yǎng)前無(wú)明顯差異，均為 550 μm;5 μg/L PDGFBB 組可見(jiàn)劃痕寬度為 140 μm;PDGFBB≥10 μg/L時(shí)劃痕已完全修復(fù)，寬度為0 μm。即經(jīng)24 h細(xì)胞劃痕完全愈合所需的PDGFBB最低濃度為10 μg/L。

2.3 NaAsO2對(duì)細(xì)胞遷移抑制率的作用 NaAsO2作用細(xì)胞24 h后，劃痕寬度隨著NaAsO2濃度的增高越來(lái)越寬，代表細(xì)胞遷移抑制率隨著NaAsO2濃度的增加而增加，其抑制作用呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。2.5～20 μmol/L NaAsO2組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 不同濃度 NaAsO2作用下 MMP3 mRNA的表達(dá) 0、5、20 μmol/L三組中 MMP－3 mRNA 表達(dá)灰度值為:4.58 ± 1.14，2.06 ± 0.37，1.12 ± 0.68。5、20 μmol/L 組與 0 μmol/L 組相比MMP－3表達(dá)下調(diào)，其中20 μmol/L組下調(diào)的更為明顯(P＜0.05)，20 μmol/L 組與5 μmol/L 組相比 MMP－3 表達(dá)也明顯下調(diào)(P＜0.05)。可見(jiàn)，MMP－3 mRNA的表達(dá)隨著濃度的NaAsO2增加而逐漸降低，有劑量依賴效應(yīng)。見(jiàn)圖2。

表1 NaAsO2對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用(n=3，±s)

表1 NaAsO2對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用(n=3，±s)

組間比較:1)P＜0.05

組別 劃痕寬度(μm) 抑制率(%)空白對(duì)照組 －0 2.5 μmol/L NaAsO2組 49.7 ±3.061) 23.991)5 μmol/L NaAsO2組 73.0 ±6.081) 35.271)10 μmol/L NaAsO2組 126.0 ±8.181) 60.871)20 μmol/L NaAsO2組 180.0 ±23.891) 86.961)

圖2 不同NaAsO2濃度組中MMP3 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是決定血管活性的重要因素，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是血管損傷后修復(fù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，所以研究血管損傷修復(fù)需要一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定表達(dá)人 PDGFRβ的PAE細(xì)胞，加入PDGFBB后，該通路被激活，可以引起明顯的細(xì)胞遷移〔4〕。由于PAE本身并不表達(dá)PDGFRβ，所以這個(gè)模型建立成功后，可以更好地研究砷劑影響細(xì)胞遷移是否與PDGFR通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著砷濃度增加，細(xì)胞遷移受到抑制，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明砷中毒后破壞了血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)功能，這可能是隨著砷中毒病情的進(jìn)展會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，甚至腫瘤形成的一個(gè)重要原因。

MMP3的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的重建，可以降解幾乎全部的細(xì)胞外基質(zhì)成分。正常情況下MMP3處于很低的表達(dá)水平，但在外界刺激、內(nèi)環(huán)境改變(細(xì)胞因子刺激)等影響時(shí)均可引起MMP3表達(dá)的改變〔5〕。有文獻(xiàn)報(bào)道動(dòng)脈粥樣硬化患者M(jìn)MP－3表達(dá)可能受細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)〔6〕。本文在檢測(cè)MMP3表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在PDGFBB刺激下，MMP3表達(dá)增強(qiáng)。但是，隨著砷濃度的增加，MMP－3表達(dá)明顯下降，提示砷劑抑制PDGFR介導(dǎo)的細(xì)胞遷移是通過(guò)下調(diào)MMP－3來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這個(gè)結(jié)論為砷中毒導(dǎo)致的心血管疾病的發(fā)生，甚至腫瘤發(fā)生的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 Woessner JF Jr.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling〔J〕.FASEB J，1991;5(8):2145－54.

2 Ogata Y，Itoh Y，Nagase H.Steps involved in activation of the pro－matrix metalloproteinase 9(progelatinase B)－tissue inhibitor of metalloproteinases－1 complex by 4－aminophenylmercuric acetate and proteinases〔J〕.J Biol Chem，1995;270(31):18506－11.

3 Libby P.Molecular bases of the acute coronary syndromes〔J〕.Circulation，1995;91(11):2844－50.

4 史艷芬，李 晶，李玉林，等.鴉膽子乙醇提取物對(duì)血小板源性生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)細(xì)胞遷移的抑制作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009;35(4):608－11.

5 欒朝霞，高沁怡，裴著果.洛伐他汀對(duì)血管平滑肌細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶3表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2003;11(4):339－41.

6 Kanaki T，Bujo H，ORI S，et al.Functional analysis of aortic endothelial cells expressing mutant PDGF receptors with respect to expression of matrix metalloproteinase－3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;294(2):231－7.ORI S，et al.