天冬總皂苷對D-半乳糖致衰老大鼠腎臟p53基因表達的影響

李艷菊 李琴山 田 碩 劉 洋 (貴陽醫學院附屬醫院血液科，貴州 貴陽 550004)

隨著我國老年人群的比重逐年增加，老年人群慢性腎功能減退的比率明顯升高。這不僅能夠導致終末期腎臟疾病，而且能夠增加老年人心血管病的發病概率，腎臟衰老正逐漸成為影響我們國民健康和社會發展的主要疾病。中藥天冬(Riadix asparag)為百合科植物天門冬〔Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.〕的干燥塊根〔1〕。其主要成分為天冬總皂苷〔2〕，研究證明天冬具有抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性〔3～6〕，但對于天冬總皂苷治療腎臟衰老的作用及其機制未見報道，本實驗通過皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型，研究天冬總皂苷治療衰老大鼠腎臟的效應及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選用清潔級雄性SD大鼠(購自第三軍醫醫科大學動物實驗中心，動物編號:2007-0005)，8～9周齡，體重160～180 g。

1.2 材料 天冬總皂苷購于上海尚誼化工科技有限公司(純度為98%);D-半乳糖 (Sigma產品);Trizol試劑、RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司);引物序列由primer 3設計，上海英俊公司合成;倒置相差熒光顯微鏡(德國Lica公司);全自動生化分析儀(德國Lica公司)。

1.3 衰老模型的制備及給藥 實驗分5組，每組隨機分配10只雄性大鼠，比較各組大鼠間的體重差異，無統計學意義;①正常組:每日皮下注射生理鹽水0.5 ml，連續注射3個月;②模型組:每日皮下注射 D-半乳糖 400 mg/kg，連續注射 3 個月〔7，8〕;③天冬總皂苷低劑量組(Asp1):每日皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型的同時，將3 g/kg天冬總皂苷灌胃治療3個月;④天冬總皂苷中劑量組(Asp2):每日皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型的同時，將6 g/kg天冬總皂苷灌胃治療3個月;⑤天冬總皂苷高劑量組(Asp3):每日皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型的同時，將12 g/kg天冬總皂苷灌胃3個月。

1.4 血清中肌酐(Cr)及尿素(UREA)的檢測 治療結束后，腹腔注射氯胺酮對大鼠進行麻醉，心臟取血，3 000 r/min離心15 min提取大鼠血清，應用全自動分析儀檢測血清中Cr及UREA的含量變化。

1.5 腎臟組織光鏡定量分析 取一側腎組織塊放入10%Formalin固定，常規石蠟包埋，切片5 μm厚，HE染色，于顯微鏡下觀察并計算各組腎小球硬化程度改變。

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)表達的測定

治療結束后對大鼠進行麻醉，心臟取血，3 000 r/min離心15 min提取大鼠血清，按照試劑盒說明書測定各組血清中和各個組織中SOD和MDA的水平。

1.7 實時PCR測定腎臟組織p53 mRNA表達 大鼠腎臟總RNA采用Trizol法提取，采用實時定量-逆轉錄聚合酶鏈反應進行基因片段擴增并定量。PCR反應各管所加模板RNA的量約為1 μg。最終通過Real-time PCR儀記錄的Ct值而對起始模板相對定量。

2 結果

2.1 尿素、肌酐的檢測 正常組與模型組，模型組與治療組，組間比較差異顯著(P＜0.05)，而且隨著天冬總皂苷劑量的增加，其降低UREA及Cr作用增強。見表1。

表1 天冬總皂苷對血清中Cr和UREA水平的影響(±s，n=10)

表1 天冬總皂苷對血清中Cr和UREA水平的影響(±s，n=10)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;3)P＜0.01，下表同

組別 UREA(mmol/ml) Cr(μmol/ml)正常組3.12±0.28 82.15±6.18模型組 7.14±0.651) 112.51±8.161)ASP1 6.09±0.422) 105.95±10.592)ASP2 4.78±0.363) 95.45±6.482)ASP3 4.02±0.213) 88.75±6.853)

2.2 腎臟組織的光鏡分析結果 100倍光鏡下，正常組無硬化腎小球存在，而模型組硬化的腎小球顯著增加，治療組隨用藥濃度的增加，其硬化率有降低趨勢。見表2。

2.3 SOD和MDA表達的測定 治療組大鼠血清中和腎臟組織中SOD活性明顯高于模型組，MDA含量明顯低于模型組，并呈劑量依賴性(P＜0.05)。表3，表4。

2.4 Real-time PCR測定腎臟組織p53 mRNA表達 模型組p53 mRNA的表達高于正常組〔(203.66±11.63)vs(72.38±5.17)，P ＜0.05〕，ASP1、ASP2、ASP3 組隨著藥物濃度的提高，p53 mRNA表達降低，有劑量依賴性〔(160.27±10.48)、(144.48±11.54)、(96.35±6.78)，P ＜0.05〕。

表2 光鏡下腎小體及硬化腎小體計數(x ±s，個/視野，n=10)

表3 天冬總皂苷對大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

表3 天冬總皂苷對大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01

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表4 天冬總皂苷對大鼠腎臟中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

表4 天冬總皂苷對大鼠腎臟中SOD活性和MDA含量的影響(±s，n=10)

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3 討論

腎臟是功能減退最快的重要器官之一，也是受衰老影響最明顯的器官之一。D-半乳糖引起的代謝紊亂使機體過氧化反應增強是其致腎臟衰老反應的重要因素〔6〕。D-半乳糖在體內氧化產生的大量自由基超過機體的清除能力，引發脂質過氧化的鏈式反應，產生大量的脂質過氧化物MDA，加重對細胞的損傷，并伴隨著抗氧化酶SOD的減少，所以本實驗采取D-半乳糖致腎臟衰老模型〔7，8〕，并發現，與模型組相比，天冬總皂苷治療組能夠提高血清與腎臟中SOD的活性、降低MDA含量，具有劑量依賴性，說明天冬總皂苷可能通過氧自由基途徑具有治療腎臟衰老的作用。

腎臟的形態學老化改變表現為腎小球硬化性改變，會出現腎小球系膜細胞增生，系膜容積相對增大，腎小球入球血管硬化，毛細血管叢較少，基膜增厚，這些改變導致腎小球濾過面積減少，本實驗發現天冬總皂苷治療組能夠降低腎小球硬化率，而且有劑量依賴趨勢。

Cr是小分子物質，可通過腎小球濾過，在腎小管內很少吸收，每日體內產生的Cr，幾乎全部隨尿排出，一般不受尿量影響。腎功能不全時，Cr在體內蓄積成為對人體有害的毒素。血Cr測定是診斷腎臟衰竭的重要指標，與腎功能的損傷程度呈正相關。UREA為人體蛋白質代謝的終末產物，主要由腎臟排泄，UREA含量的高低取決于機體的蛋白質的分解代謝與腎臟的排泄功能。在一般活動和比較穩定的情況下，血尿素和腎小球濾過功能成反比關系，UREA增高多提示腎小球濾過功能減退。本實驗說明模型組大鼠存在腎功能的減退，治療組能夠改善衰老大鼠的腎功能，并且治療組降低Cr及UREA的作用具有劑量依賴趨勢。

衰老與細胞凋亡密切相關，目前認為衰老是一種與基因相關的疾病，在衰老細胞中起重要作用的是p53抑癌基因。p53基因是重要的細胞周期、凋亡調節基因，活化的p53可以影響許多基因的表達，因此p53基因被認為是影響人類壽命的一個關鍵基因〔9～12〕。本實驗發現與模型組相比，天冬總皂苷治療組能夠降低腎臟組織p53基因表達，因此推測天冬總皂苷降低p53基因的表達可能是其改善衰老大鼠腎臟的機制之一，進而本實驗為天冬總皂苷的臨床應用提供實驗依據。

1 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典〔S〕.北京:化學工業出版社，2005:37.

2 Nishritha B，Sanjay S.Asparagus racemosus-Ethnopharmacological evaluation and conservation needs〔J〕.J Ethnopharmacol，2007;110(1):1-15.

3 Cornwell T，Cohick W，Raskin I.Review:dietary phytoestrogens and health〔J〕.Phytochemistry，2004;65(8):995-1016.

4 Parihar MS，Hemnani T.Experimental excitotoxicity provokes oxidetive damage in mice brain and attenuation by extract of Asparagus racemosus〔J〕.J Neural Transm，2004;111(1):1-12.

5 Bhattacharya A，Murugandam AV，Kumar V，et al.Effect of polyherbal formulation，EuMil，on neurochemical perturbations induced by chronic stress〔J〕.Indian J Exp Biol，2002;40(10):1161-3.

6 Dahanukar SA，Kulkarni RA，Rege NN，et al.Pharmacology of medicinal plants and natural products〔J〕.Indian J Chem，2003;32(3):81.

7 李艷菊，胡亮杉，郭坤元.骨髓間充質干細胞回輸對大鼠腎臟衰老的影響〔J〕.中華腎臟病雜志，2009;25(3):241-2.

8 李艷菊，鄧 蘭，黃 睿.骨髓間充質干細胞對大鼠腎臟衰老的影響〔J〕.中華內科雜志，2009;48(6):458-61.

9 Ander Matheu，Antonio Maraver，Manuel Serrano.The Arf/p53 pathway in cancer and aging〔J〕.Cancer Res，2008;68(15):6031-4.

10 Lawrence A，Donehower A.Using mice to examine p53 functions in cancer，aging，and longevity〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009;1(6):a001081.

11 Zhaohui Feng，Meihua Lin，Rui Wu.The Regulation of aging and longevity:a new and complex role of p53〔J〕.Genes Cancer，2011;2(4):443-52.

12 Zhaohui Feng，Wenwei Hu，Angelika K，et al.Declining p53 function in the aging process:a possible mechanism for the increased tumor incidence in older populations〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(42):16633-8.