滇藁本中黃酮類化合物的提取工藝＊

段利平，劉記言，劉學娟，楊德娥，朱云勇，白紅麗

（云南民族大學 國家民委－教育部民族藥資源化學重點實驗室，云南 昆明 650031）

彝藥滇藁本為傘形科滇芹屬（Sinodielsiayunnanensis Wolff），別名巖林、巖前胡，產自云南中部和西部，始載于《滇南本草》，治頭風疼痛，止諸頭疼，明目［1］。彝族主要用于偏頭痛，腎盂腎炎，呼吸道感染等癥［2］。初步研究表明，滇藁本能減緩血細胞凝聚。為了更好的挖掘利用民族藥資源，最大限度的提取其中的有效成分，筆者對滇藁本進行了醇提工藝的研究，建立了滇藁本中總黃酮類化合物的高效液相色譜測定方法。

1 材料與方法

1.1 藥 材、儀器及試劑 藥材：滇藁本采自紅河哈尼族彝族自治州瀘西縣，經鑒定為傘形科滇芹屬（Sinodielsiayunnanensis Wolff）的根部，粉碎過40目篩，干燥保存。試劑：鹽甲醇（色譜純）；槲皮素（對照品，中國藥品生物制品檢定所）；去離子水。儀器：Agilent1100型高效液相色譜儀、Zorba／sb－C18色譜柱（150.0mm ×4.6mm，5μm）、紫外檢測器、自動進樣器、在線真空脫氣機、智能化柱溫箱及Agilent化學工作站、R－114型旋轉蒸發儀（BüchI）、電熱恒溫水浴鍋、CQX25－06超聲波清洗器、AE100型電子天平。

1.2 方法和結果

1.2.1 黃酮類檢測 取滇藁本藥材粗粉10g，加甲醇70mL，置水浴中回流10min，趁熱過濾。取濾液2滴于濾紙上，加10%三氯化鋁乙醇溶液2滴，揮干，置熒光燈下觀察，有熒光產生。

1.2.2 提取工藝條件的確定 采用正交試驗來確定滇藁本中黃酮類化合物最佳提取工藝條件。以總黃酮的提取率為評價指標，乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取方法（C）、提取時間（D）為考察的4個因素，每個因素各取3個水平（表1），選用L9（34）正交表進行試驗（表2）。取藥材每份50g，提取液過濾、減壓蒸餾濃縮浸膏，再定容至50mL容量瓶中，作為供試液備用。測定前充分搖勻。按正交試驗設計要求試驗。

表1 因素水平表

表2 正交試驗設計表及結果

1.2.3 結果方差分析 對正交試驗結果進行方差分析，由滇藁本藥材粗粉中槲皮素含量的直觀分析結果可知，各因素對實驗結果的影響程度為A＞D＞B＞C，所得最佳提取工藝為A3B1C1D3。由方差分析可知，提取方法、加醇量、提取時間、乙醇濃度對滇藁本藥材粗粉的槲皮素含量和總固體物收率都有顯著的影響，但提取時間影響最顯著，確定最佳提取工藝為A3B1C1D3。即加8倍量的70%乙醇，熱回流提取3h。F1－0.05（2，2）＝19.0，F1－0.01（2，2）＝99.0，F1－0.10（2，2）＝9.00。

2 實驗內容

2.1 對照品貯備液的制備 取干燥至恒重的對照品，精密稱定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備 取樣品約5mL，用20mL甲醇于超聲波浴中提取30min，過濾后濾液加入20mL 1.5mol／L鹽酸于水浴上回流水解3h，冷卻后用甲醇定容至50mL量瓶中，該樣液過0.5μm膜，濾液進HPLC分析。

2.3 測定波長的選擇與色譜條件 色譜條件 固定相：Zorba／sb－C18色譜柱（150.0mm ×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－0.1%磷酸（50∶50）；流速：10μL／min；檢測波長：371nm；柱溫：20℃。分離度符合要求。測定波長的選擇 使用HPLC在線掃描槲皮素的對照品紫外光譜圖中（以流動相為溶劑），最大吸收波長為371nm（見圖1）。根據實驗結果，為使成分的色譜峰相匹配，本實驗中選擇371nm為測定波長。

圖1 HPLC在線掃描槲皮素對照品紫外光譜圖

2.4 系統適用性試驗 分別吸取供試品及對照品溶液，注入色譜儀，在上述色譜條件下進樣，得HPLC圖譜（見圖2（A、B），分析得系統適用性實驗結果。

圖2（A） 槲皮素對照品的HPLC圖譜

圖2（B） 供試品的HPLC圖譜

2.5 標準曲線及線性范圍 線性關系考察 精密稱取槲皮素對照品2.9mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取1.0mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即為槲皮素對照品貯備液；精密吸取以上貯備液，按表1設計進樣量進行HPLC，測定色譜峰面積，以峰面積（A）對對照品濃度（C）進行回歸分析。測得槲皮素對照品的線性回歸方程為：y＝32.151x＋11.333，r＝0.9998。表明槲皮素在0.0464～0.1624μg／mL范圍內線性關系良好。

2.6 穩定性試驗 在色譜條件下，取同一份滇藁本藥材粗粉的供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10h進樣測定，結果槲皮素峰面積值RSD＝0.94%。表明在10h內樣品溶液中的槲皮素穩定。

2.7 精密度試驗 精密吸取槲皮素對照品溶液10μL，連續進樣6次，測定峰面積值，計算RSD＝0.35%。

2.8 重復性試驗 同一批號樣品6份，按供試品溶液制備項下方法制備并測定，結果槲皮素含量為的0.0132%。

2.9 回收率試驗 精密稱取干燥至恒重的對照品適量，加入溶劑制成回收率試驗用對照品儲備液。取已知槲皮素含量（0.01585mg／mL）的樣品6份，每份約0.65g，分別精密加入槲皮素對照品溶液（0.0116mg／mL）1mL，按供試品溶液制備項下方法制備并測定，結果平均回收率為96.44%，RSD為1.51%。

2.10 樣品含量測定 取不同批號的樣品數批，依測定條件，制成供試品溶液，注入色譜儀，測定，記錄并計算指標槲皮素的含量。見表3。

表3 槲皮素含量測定

3 討論

滇藁本藥材粗粉中含多種黃酮類化合物，根據黃酮類化合物在70%乙醇中具有良好溶解性的特點，我們在本實驗中選擇70%乙醇作提取溶劑。根據實驗分析滇藁本藥材粗粉中黃酮類化合物大多以糖苷的形式存在，主要為槲皮素及苷、山柰素及苷等，直接測定滇藁本藥材粗粉中槲皮素的含量，發現其含量很低，并且直接測定可能難以準確反映其中總黃酮的實際含量，因此本試驗采取酸水解后測定其槲皮素的含量，獲得滿意效果。對于水解條件的選擇，考察了不同鹽酸濃度和酸水解時間的影響。結果顯示，用鹽酸（1.5mol／L）－甲醇（1∶1）回流3h，能使滇藁本藥材粗粉中以槲皮素為苷元的黃酮苷水解完全，鹽酸的濃度不宜再高，酸性太強對進樣閥和色譜柱的腐蝕作用較大。色譜條件摸索時，發現流動相的pH值對色譜峰的峰形及分離度影響很大，比較甲醇與不同濃度的磷酸溶液等多種溶劑系統，確定流動相為甲醇－0.1%磷酸（50∶50），得到的色譜峰峰形尖銳，分離度高，且基線穩定。

［1］《滇南本草》整理組 .滇南本草［M］.昆明：云南人民出版社，1978.

［2］江蘇植物所 .新華本草綱要［M］.上海：上海科技出版社，1988.

［3］HU Min，SKIBSTED L H.Antioxidative capacity of rhizome extract and rhizome knot extract of edible lotus（Nelumbo nuficera）［J］.Food Chem，2002，76：327～333.

［4］左愛華，韋群輝，曾元兒，等 .紫外可見分光光度法測定青刺尖總黃酮含量［J］.云南中醫中藥雜志，2008，（6）：43～44.