依那普利拉通過調控PKC/TGF－β1通路抗鼠心室成纖維細胞增殖

于 靜 孫紅霞 (北華大學化學學院，吉林 吉林 3203)

心肌纖維化(MF)表現為以心室成纖維細胞增殖和間質膠原過度沉積及異常分布為特征的心臟重構。血管緊張素(Ang)Ⅱ通過心室成纖維細胞(CFb)上的AT1受體，導致CFb增殖和膠原合成增加，引起心肌纖維化〔1〕。目前的研究結果顯示，依那普利拉(Ena)是依那普利的活性成分，可用于治療高血壓、心肌梗死、心力衰竭、心室重構等疾病，但其抑制mF的分子機制，尤其信號傳導通路的研究很少〔2〕。本實驗在細胞水平上觀察Ena對AngⅡ誘導CFb增殖、細胞周期、Ⅲ型膠原纖維(collagen)Ⅲ含量、蛋白酶C(PKC)和轉化生長因子(TGF)－β1蛋白表達及PKC抑制劑白屈菜赤堿(Chele)對上述各指標影響，揭示其抗MF作用的信號通路。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及細胞 Ena(江蘇常州制藥廠200616);白屈菜赤堿，胰蛋白酶:寶泰克生物試劑;AngⅡ，PKC，TGF－β1(小鼠抗大鼠單克隆抗體)、四氮唑鹽(MTT)均為sigma公司產品;IMDM培養基購自HyClone Utah公司;胎牛血清(FCs):杭州四季青;Heraeus型CO2培養箱;SUNRISE TECAN FO39300型自動酶聯檢測儀(澳大利亞);日本Olympus倒置顯微鏡;超凈工作臺;S－P免疫組化試劑盒:福州邁新;出生1～3 d的Wistar大鼠心室，胰酶消化，收集細胞，置于含100 ml/L FCs的IMDM培養液中，在 50 ml/L CO2、37℃、飽和濕度條件下培養60～90 min。采用差速貼壁法，分離CFb，加入含100 ml/L FCs的IMDM繼續培養。經倒置顯微鏡、透射電鏡、免疫組化纖維黏連蛋白染色陽性和平滑肌肌動蛋白染色陰性鑒定為所需的CFb，純度達98%，生長近融合時按1∶3傳代，實驗采用2～4代細胞。

1.2 實驗分組 分為五組，Control:含有IMDM的培養液;AngⅡ組:培養液中加入終濃度為10－7mol/L的AngⅡ;Chele+AngⅡ組:培養液中同時加入終濃度為 10－7mol/L AngⅡ和10－6mol/L Chele;Chele+AngⅡ+Ena組:培養液中同時加入10－7mol/L AngⅡ 和 10－6mol/L Chele 及 10－6mol/L Ena;10－6mol/L Ena組:培養液中同時加入 10－6mol/L Ena和10－7mol/L AngⅡ。

1.3 MTT比色法檢測細胞增殖活力 各組細胞接種于96孔培養板，每組細胞7復孔，藥物干預24 h，于培養結束前4 h，加入5 g/L MTT 10 μl，待形成藍紫色的結晶沉淀后加入DMSO 150 μl使沉淀降解，在酶聯免疫檢測儀上490 nm波長處測定光吸收值(A值)，用只加培養液不加細胞的空白孔調零。各實驗組與AngⅡ相比較的光吸收值(A值)差值百分率表示CFb增殖抑制率。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期 各處理組作用24 h后，收集各組細胞，－20℃ 70%乙醇過夜后，冰浴，離心，重懸于 PBS，取適量細胞懸液加入RNA酶，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶染液，暗處冰浴30 min。上機前用300目尼龍網過濾。根據碘化丙啶所標記的DNA含量確定細胞所處的周期。計算出細胞周期各時相分布的百分比。

1.5 免疫細胞化學染色法檢測collagenⅢ表達 將CFb放入預先放置有幾張7 mm×7 mm蓋玻片的24孔培養板中培養，各種處理因素作用24 h后，將蓋玻片取出后用PBS洗滌2次，多聚甲醛固定，SP法進行免疫細胞化學染色，具體步驟參照說明。PBS取代一抗作陰性對照。胞質顯示棕黃色顆粒細胞為陽性細胞，將玻片于光學顯微鏡下放大400倍，通過ALTAU2圖像采集卡采集圖像，Image－ProPlus4.5圖像分析系統進行計算機圖像分析，其陽性追蹤點為表達于胞質的棕黃色定位。計算切片各視野陽性點面積總和及光密度均值，分析各組collagenⅢ在CFb中的平均陽性強度百分比(%)。

1.6 免疫印跡檢測PKC和TGF－β1蛋白 各處理因素分別作用于24 h后，收集細胞，蛋白提取用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100 V 20 mA電轉移2 h，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，加1∶1000稀釋的小鼠抗大鼠TGF－β1單克隆抗體，4℃孵育過夜，用1∶200稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體室溫孵育2 h，洗膜，DAB顯色。采用凝膠成像分析系統分析PKC和TGF－β1灰度值，用其與β－actin比值表示蛋白質含量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理，計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 IC檢測collagenⅢ表達 與對照組(5.65±1.09)相比，AngⅡ組(15.89±3.77)陽性染色細胞數增加，collagenⅢ表達量明顯增加(P＜0.01);與 AngⅡ相比，Chele+AngⅡ組(7.34±1.67)和AngⅡ+Ena組(6.84±2.57)collagenⅢ表達降低(P＜0.01)，AngII+Chele+Ena組最為明顯(4.67±1.16)(P＜0.001)，與 AngⅡ +Chele組比較也有顯著差異(P＜0.01)。說明AngⅡ通過激活PKC通路促進膠原纖維蛋白分泌;各干預組能不同程度抑制collagenⅢ表達。見圖1。

2.2 MTT法檢測對CFb增殖的抑制作用 AngⅡ能顯著提高CFb對MTT的代謝率，MTT值明顯升高，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.001)，說明AngⅡ對CFb有明星促增殖作用，加入各不同處理因素后，各組MTT值顯著低于AngⅡ組，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 AngⅡ組CFb S期的細胞百分率顯著高于對照組，G0/G1期細胞百分率顯著低于對照組(P＜0.01);給予各不同處理因素后，CFb S期的細胞百分率顯著降低，而 G0/G1期細胞百分率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

圖1 免疫組化染色法檢測Chele和Fna對collagenⅢ表達的影響

表1 Chele和Ena對CFb增殖的抑制作用( ± s，n=7)

表1 Chele和Ena對CFb增殖的抑制作用( ± s，n=7)

與Control組比較:1)P＜0.001;與AngⅡ組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與AngⅡ+Chele組比較:4)P＜0.05

組別 MTT－OD 抑制率(%)50.10 Control 0.2735±0.1471 69.80 AngⅡ 0.9055±0.13461) －AngⅡ +Chele 10－6 0.4132 ±0.15473) 54.38 AngⅡ +Chele+Ena10－6 0.3153 ±0.12013)4) 65.18 AngⅡ +Ena10－6 0.4518 ±0.23182)

表2 Chele和Ena對細胞周期的影響( ± s，n=7，%)

表2 Chele和Ena對細胞周期的影響( ± s，n=7，%)

與Control組比較:1)P＜0.01;與AngⅡ組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與AngⅡ+Chele組比較:4)P＜0.05;下表同

組別 G0/G1 S G2/M 1.2±1.8 Control 83.7±2.6 10.11±4.1 6.19±1.7 AngⅡ 75.6±8.71) 20.6±3.81) 3.8±1.5 AngⅡ +Chele 10－6 90.2±4.32) 5.6±3.12) 4.2±3.5 AngⅡ +Chele+Ena 10－6 92.6±5.33)4) 3.3±1.23)4) 4.1±3.0 AngⅡ +Ena10－6 91.7 ±2.53) 7.1 ±2.32)

2.4 Western印跡檢測PKC和TGF－β1蛋白表達 與對照組比較，AngⅡ組PKC和TGF－β1蛋白表達量明顯升高(P＜0.01)。與AngⅡ相比，Chele+AngⅡ組和 Ena+AngⅡ組對 PKC和TGF－β1的蛋白表達具有明顯的抑制作用(P＜0.05)，AngⅡ+Chele+Ena10－6組抑制作用最強(P ＜0.01)，且與 Chele+AngⅡ組比較有顯著差異(P＜0.05)，見圖2，表3。

圖2 免疫印跡檢測Chele和Ena對PKC和TGF-β1蛋白表達的影響

表3 Chele和Fna對PKC 和TGF-β1蛋白表達的影響( ± s，n=6)

表3 Chele和Fna對PKC 和TGF-β1蛋白表達的影響( ± s，n=6)

組別 PKC/β－actin TGF－β1/β－actin Control 1.00±0.16 1.00±0.25 AngⅡ 3.98±0.521) 9.66±1.511)Chele+AngⅡ 1.91±0.332) 3.79±0.252)AngⅡ +Chele+Ena 10－6 0.95 ±0.123)4) 1.16 ±0.472)4)AngⅡ +Ena10－6 2.82 ±0.272) 2.87 ±0.252)

3 討論

心肌纖維化(MF)表現為心室CFb過度增殖，間質膠原分泌增加，并參與心室重塑。文獻報道，多種信號通路參與了MF發生和發展〔3，4〕。AngⅡ通過作用于CFb上的AT1型受體，通過G蛋白激活磷脂酶C(PLC)，PLA2和PLD。PLC催化PIP2生成二?；视?DG)和三磷酸肌醇(IP3)，IP3促進Ca2+的釋放，可間接活化PKC，DG直接活化PKC從而促進心室CFb增殖。PKC活化后還可直接經核蛋白磷酸化，與轉錄因子c－Myc、NF－κB、c－Fos、c－Jun(c－Fos，c－Jun 構成活性蛋白 AP－1)結合，啟動基因轉錄和蛋白質翻譯過程，還可激活MAPK等途徑誘導MF發生 ROS－MAPK〔4〕。

TGF－β1是導致MF等諸多因素最后的共同中介之一，能使體外培養細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達增加，并增加Ⅰ型膠原mRNA的穩定性。近年研究發現，TGF－β1和AngⅡ之間有密切作用，在心肌纖維化過程中，AngⅡ增加TGF－β1基因的表達;而TGF－β1則抑制細胞外基質降解，增加細胞外基質mRNA表達和蛋白質合成〔5〕。TGF－β1在心肌中對于細胞增殖、分化、遷移和細胞外基質的沉積均有重要的作用，TGF－β1受體在心肌細胞和非心肌細胞均有分布〔5〕，實驗證明新生鼠心肌細胞表面存在 TGF－β1Ⅰ型受體、Ⅱ型受體和Ⅲ型受體〔6〕。TGF－β1受體還存在于心肌成纖維細胞〔7〕。Yao〔8〕等發現在心肌成纖維細胞中，TGF－β1可激發膠原酶和膠原酶啟動子的活性。有實驗證明AngⅡ通過TGF－β1誘導細胞外基質的合成〔9〕。丹參酮系唇形科丹參的干燥根提取物，是常用的活血化瘀中藥，研究表明丹參在治療心腦血管疾病及抗衰老等方面具有顯著療效。其抗心肌纖維化作用較為肯定的是丹參酮ⅡA，具有抗急性缺氧、抗心律失常、改善血管平滑肌、抗心肌肥厚以及抗血小板聚集等作用〔10〕。

本實驗結果顯示，PKC抑制劑Chelerythrine能明顯抑制AngⅡ促CFb增殖和collagenⅢ分泌，降低TGF－β1蛋白表達，抑制CFb增殖作用。說明AngⅡ誘導MF作用通過激活PKC信號通路實現;Chele+Ena組共同作用后，可使AngⅡ作用下的CFb MTT－OD值進一步降低，同時Ⅲ型膠原含量明顯下降，細胞周期G0/G1期細胞百分比明顯增多，S期細胞百分比明顯減少，PKC和TGF－β1蛋白表達減少，與Chele+AngⅡ比較有顯著差異。表明Ena可能與Chele協同作用，通過阻斷PKC通路，抑制TGF－β1蛋白表達從而抑制AngⅡ誘導的CFb增殖和間質纖維分泌，顯示細胞內PKC活性受到抑制后AngⅡ誘導的CFb增殖受阻。Chele+AngⅡ組和Ena+AngⅡ組比較上述各指標無顯著差異，Ena組與AngⅡ組比較，數值雖有不同程度下降，但尚未降至正常水平，表明Ena只是部分阻斷PKC激活通路，由此看出除PKC參與AngⅡ促CFb增殖過程外，可能還有其他的通路存在〔11，12〕。

由上可知，AngⅡ通過作用于CFb AT1受體，激活PKC通路，促進CFb增殖和膠原合成，誘導MF的發生。Ena通過部分抑制PKC通路的激活，降低CFb增殖和間質纖維蛋白的合成和分泌，拮抗AngⅡ的部分生物活性，降低TGF－β1蛋白表達，抑制心室CFb增殖和纖維分泌，從而抑制MF的發生。其通過何種機制阻斷PKC通路，是直接還是間接作用，阻斷哪種PKC亞型，有待于后續研究進一步證實。

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