小鼠全長膜型Klotho蛋白cDNA表達體系的構建與應用

李寶善 王艷嬌 馬厚勛 吳 平 (重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科，重慶 400016)

小鼠全長膜型Klotho蛋白cDNA表達體系的構建與應用

李寶善 王艷嬌 馬厚勛 吳 平 (重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科，重慶 400016)

目的 克隆編碼小鼠膜型Klotho(mKL)蛋白的cDNA片段，構建、包裝Klotho重組腺相關病毒表達體系，并檢測rAAV/mKL載體表達功能。方法 選擇RT-PCR擴增小鼠全長mKL蛋白的基因片段，將該片段亞克隆至腺相關病毒載體pAAV-IRES-hnGFP，采用酶切及DNA測序鑒定;利用AAV-293細胞包裝rAAV/mKL，經轉染7901細胞，檢測其Klotho表達情況。結果 本文成功克隆出序列信息和讀碼框完全正確的3 064 bp的小鼠Klotho基因片段，并構建pAAV/mKL克隆。在AAV-293細胞中包裝出rAAV/mKL，病毒原液轉染7901細胞后其Klotho mRNA表達上調，而細胞上清液Klotho蛋白也明顯增加(P＜0.01)。結論 成功構建小鼠Klotho重組腺相關病毒載體(pAAV/mKL)，獲得了rAAV/mKL，并經轉染7901細胞驗證其基因表達功能正常，這就為進一步研究Klotho基因治療衰老相關性疾病提供了技術基礎。

Klotho;基因克隆;腺相關病毒;載體構建;病毒包裝

目前研究證實分泌型的KL蛋白實質上是膜型KL蛋白細胞外區可被錨定在細胞膜上的如ADAM10和ADAM17等金屬蛋白酶水解脫落而產生的〔1，2〕，其作為一種循環因子或激素，可抑制細胞內胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/IGF-1)信號級聯放大效應〔3〕，而Klotho蛋白抑制胰島素、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)信號轉導的能力可能與其抗衰老特性有關。另外分泌型klotho還具有調節離子通道活性，抑制氧化應激、抑制Wnt信號轉導以及增加一氧化氮合成等作用〔4，5〕。新近國外研究證實在自發性高血壓大鼠應用全長Klotho cDNA腺相關病毒遞送能夠阻止其病程進展和血壓增高以及腎臟損害〔6〕，其作用可能是通過增加Klotho表達來實現的，這提示重組Klotho cDNA腺相關病毒載體轉染可為高血壓長期控制和腎臟保護治療提供一條新途徑。現有研究證實分泌型的Klotho蛋白實質上就是全長膜型Klotho蛋白(mKL)蛋白細胞外區的水解脫落成分，為此，本研究擬通過采用更優化的實驗方法克隆編碼mKL蛋白cDNA，并構建其重組腺相關病毒載體，以便為后續研究Klotho基因治療高血壓、2型糖尿病、原發性骨質疏松等衰老相關性疾病提供技術條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠及質粒載體和菌株 5周齡昆明小鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心。pMD19-T載體由TaKaRa公司生產，腺相關病毒質粒載體 pAAV-IRES-HnGFP、AAV-RC、AAV-Helper為Stratagene公司產品。TOP10感受態細胞為重慶市眼科學重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 PCR產物加A尾試劑盒、DNA Marker、T4 DNA連接酶為TakaRa公司產品，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。基因測序由上海英濰捷基公司、寶生物(大連)公司完成。Lipofectamine 2000購自英濰捷基(上海)公司，DMEM高糖培養基、1640培養基、胎牛血清購自Hyclone公司。小鼠Klotho蛋白ELISA試劑盒為R＆D分裝產品。

1.1.3 主要儀器 Nano Drop2000微量分光光度計(Thermo)，s1000 PCR儀、DNA電泳凝膠成像系統(Bio-Rad)，Leica ebq100倒置熒光顯微鏡，HEPA Class100恒溫細胞培養箱(Thermo)。本實驗研究所需的實驗場地及儀器均為重慶市眼科學重點實驗室提供。

1.2 方法

根據分子生物學技術方法并在國內趙景宏等〔7〕文獻報道的兩步法基礎上，建立和完善了更有效、切合實際、條件優化的實驗技術方法與操作規程，確保本實驗方法的可行性。

1.2.1 小鼠的腎臟組織總RNA提取 取約100 mg小鼠腎臟組織按RNAiso Plus說明書提取總RNA，并溶于DEPC處理水。

1.2.2 克隆編碼小鼠全長mKL蛋白的基因 用小鼠的腎臟組織總RNA，應用反轉錄擴增Klotho基因序列。根據本研究需要設計PCR的特異性上游引物序列為：5'ccggaattcctagcccg-3'(斜體下劃線部分為EcoR I酶切位點，黑體加框部分為翻譯起始密碼子)，特異性下游引物序列為：5'gccgctcgagcttataacttctc 3'(斜體下劃線部分為Xho I酶切位點，黑體加框部分為翻譯終止密碼子)(NM_013823.2)，其PCR產物長度為3 064 bp;并選擇大鼠β-actin mRNA(NM_013823.2)為本研究PCR實驗內參，上游引物序列為：5'GCGACGAGGCCCAGAGCAAG 3';下游引物序列為：5'TGGAGGGGCCGGACTCATCG 3'，PCR產物長度為942 bp。擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定片段大小，膠回收PCR產物，加A尾，連接pMD19-T載體送上海英濰捷基公司進行DNA測序。

1.2.3 編碼小鼠mKL蛋白的全長cDNA片段的獲得 將測序結果正確的pMD19-T/mKL EcoR I/Xho I雙酶切。膠回收3 kb左右條帶，即為mKL cDNA片段，置pH7.5 TE緩沖液中，－20℃保存。

1.2.4 重組pAAV/mKL質粒的構建 應用EcoR I/Xho I對腺相關病毒空載體pAAV-IRES-HnGFP進行雙酶切，膠回收目的片段，然后將酶切后載體與之前酶切回收mKL cDNA片段按1∶10(摩爾數比)進行連接，轉化TOP10感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37℃培養過夜。

1.2.5 重組pAAV/mKL質粒的篩選與鑒定 經含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落振蕩培養過夜后提取質粒，通過EcoR I/Xho I酶切對重組質粒pAAV/mKL進行鑒定。最終將鑒定陽性重組質粒送寶生物生物工程公司進行DNA測序，測序結果與GenBank中所報道目的基因序列進行比對分析。

1.2.6 重組rAAV/mKL病毒包裝 AAV Helper-Free System試劑盒推薦用2×HBS+0.3 M CaCl2即磷酸鈣共沉淀法轉染技術，而本實驗研究通過探索、優化轉染實驗條件，發現采用Lipofectamine 2000介導轉染方法，其轉染率及包裝效率能得到顯著提高。

1.2.7 rAAV/mKL轉染7901細胞后其KL mRNA表達 在12孔板用含10%胎牛血清的1640培養基培養7901細胞，待細胞融合到80%，換含2%胎牛血清的DMEM培養基，加含rAAV/mKL病毒原液200 μl，2 h后換為10%胎牛血清的1640培養基，48 h后收集細胞，按RNAiso Plus說明書提取總RNA，逆轉錄，用Premix Taq酶PCR驗證Klotho基因表達，所用上、下游PCR引物序列分別為 5'GGGTCACTGGGTCAATCT 3'和 5'GCAAAGTAGCCACAAAGG-3'(NM_013823.2)，PCR產物長度為710 bp。內參同前。

1.2.8 rAAV/mKL轉染7901細胞后其KL蛋白表達 在12孔板用含10%胎牛血清的1640培養基培養7901細胞，待細胞融合到80%，換含2%胎牛血清的DMEM培養基，加含rAAV/mKL病毒原液200 μl，2 h后換為10%胎牛血清的1640培養基，48 h后收集細胞上清液，按ELISA試劑盒說明操作。重復5次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 編碼小鼠全長mKL蛋白的基因克隆與鑒定

通過對PCR的退火溫度進行梯度篩選，結果顯示在退火溫度為56℃條件時其特異的DNA片段擴增效果最好，為此，本研究選用56℃為退火溫度條件，其所得PCR產物電泳結果顯示其產物長度約3 000 bp，與預期目的片段大小一致(見圖1)。通過回收PCR產物，加A尾后，與pMD19-T載體進行連接、再擴增，并經EcoR I/Xho I酶切，其產物電泳結果顯示目的片段成功克隆至pMD19-T即提示載體構建獲得成功，隨后DNA測序檢測結果也表明所擴增的DNA片段序列與小鼠膜型Klotho mRNA基因序列完全一致。見圖1。

2.2 編碼小鼠全長mKL蛋白cDNA片段的獲得

將測序結果正確的pMD19-T/mKL質粒EcoR I/Xho I雙酶切，電泳結果可見大小約2 670 bp的pMD19-T片段和約3 kb的mKL cDNA，膠回收約3 kb條帶，獲得了編碼小鼠膜型Klotho蛋白的全長cDNA片段。

2.3 重組pAAV/mKL質粒的構建與鑒定

經過酶切、連接、轉化和氨芐青霉素抗性篩選，提取質粒后酶切鑒定，獲得陽性重組質粒pAAV/mKL。測序結果顯示，質粒中含有與GenBank和文獻報道序列一致且讀碼框完全正確的小鼠全長膜型Klotho cDNA序列，表明小鼠膜型全長Klotho重組腺相關病毒載體構建成功。見圖1。

2.4 重組AAV/mKL病毒包裝

本研究將AAV-RC、AAVHelper、pAAV/mKL三質粒等比例與Lipofectamine 2000共轉染AAV-293細胞。其結果顯示48 h后可見綠色熒光表達即提示有病毒產生，72 h后綠色熒光最為明顯，并有部分熒光淬滅(見圖2)。

2.5 rAAV/mKL轉染7901細胞后Klotho mRNA表達情況

病毒原液轉染7901細胞48 h后收集細胞，提取總RNA。其結果顯示病毒轉染后7901細胞的Klotho基因mRNA表達顯著增加，見圖1。

2.6 rAAV/mKL轉染7901細胞后Klotho蛋白表達情況

病毒原液轉染7901細胞48 h后收集細胞培養上清液，應用ELISA法檢測培養上清液中分泌型Klotho蛋白(來源于膜型Klotho蛋白脫落入培養液中部分)。其結果顯示病毒原液轉染組：(75.52±7.02)U/L，空白對照組：(46.78 ±2.64)U/L;即病毒原液轉染組較空白對照組分泌型Klotho蛋白明顯升高，有顯著性差異(P=0.003)。

圖1 PCR、酶切后凝膠電泳圖

圖2 共轉染AAV-293細胞后GFP表達情況(×100)

3 討論

Klotho基因是新近研究發現的一種與壽命和各種衰老相關表型(如心血管疾病、肺氣腫、骨質疏松等)相關的基因，而目前有關Klotho基因與人類疾病的關系也在不斷探索中。

基于本實驗涉及Klotho基因片段較長，超過3 000 bp，而在現有的文獻中對超長片段基因的高保真克隆方法報道甚少。為此，本實驗在傳統兩步RT-PCR法基礎上通過改良優化實驗方法，實現了超長片段基因的膜型Klotho蛋白cDNA克隆之目的。

眾所周知pAAV-IRES-HnGFP質粒構建時，如果插入片段過長會影響AAV的轉染效率(如pAAV-IRES-HnGFP質粒說明書中推薦插入片段常不超過1 700 bp)。本實驗研究采用Stratagene公司AAV Helper-Free System腺相關病毒包裝試劑盒(即包括AAV-RC、AAV-Helper兩種質粒)和自行構建的含全長膜型Klotho cDNA及HnGFP的pAAV/mKL三種質粒共轉染AAV-293細胞、包裝病毒時發現該試劑盒所推薦的2×HBS+0.3 mol/L CaCl2對本實驗轉染細胞存活率影響較大，為此，本研究通過探索、優化和篩選轉染條件，最終確定采用 Lipofectamine 2000介導轉染方法，能得到顯著提高其轉染率及包裝效率，為本研究實驗順利進行提供了技術方法。

近年來，學者對基因治療心血管性疾病進行了較多研究〔8〕，而病毒載體的選擇對后續基因治療研究也致關重要。如腺病毒載體因為其最大可攜帶7.5 kb的外源基因，轉染效率高、靶器官廣泛等優點應用最多;但是腺病毒載體轉染的基因表達時間短，大約為2～3 w，免疫反應大，不適合慢性疾病的防治。而腺相關病毒因為能定點整合到宿染色體19q13.3的特定DNA上，其攜帶的外源基因表達穩定，持續時間長，具有廣闊的宿主細胞譜〔9〕，且引起免疫反應輕〔10〕。

本實驗選擇腺相關病毒為后續基因治療的載體，通過克隆獲得編碼小鼠全長mKL的cDNA片段，并將其裝載至腺相關病毒載體之中，獲得了含超長cDNA片段的rAAV/mKL病毒載體;并通過病毒轉染細胞驗證其具有表達Klotho mRNA及蛋白功能，這為構建rAAV/mKL載體應用于高血壓、糖尿病、骨質疏松等衰老相關疾病中的干預研究提供了技術條件及實驗依據。

1 Chen CD，Podvin S，Gillespie E，Leeman SE，Abraham CR.Insulin stimulates the cleavage and release of the extracellular domain of Klotho by ADAM10 and ADAM17〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(50)：19796-801.

2 Bloch L，Sineshchekova O，Reichenbach D，Reiss K，Saftig P，Kuro-o M，Kaether CKlotho is a substrate for alpha-，beta-and gamma-secretase〔J〕.FEBS Lett，2009;583(19)：3221-4.

3 Torres PU，Prié D，Molina-Blétry V，et al.Klotho：an antiaging protein involved in mineral and vitamin D metabolism〔J〕.Kidney Int，2007;71(8)：730-7.

4 Kawaguchi H，Manabe N，Miyaura C，et al.Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia〔J〕.J Clin Invest，1999;104：229-37.

5 Liu H，Fergusson MM，Castilho RM，et al.Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging〔J〕.Science，2007;317：803-6.

6 Yuhong Wang，Zhong jie Sun.Klotho Gene Delivery Prevents Progression of Spontaneous Hypertension〔J〕.Hypertension，2009;54：810-17.

7 趙景宏，王軍平，陳 默.編碼小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重組腺相關病毒載體構建〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(19)：2452-5.

8 Jones WS，Annex BH.Growth factors for therapeutic angiogenesis in peripheral arterial disease〔J〕.Curr Opin Cardiol，2007;22(5)：458-63.

9 《中國組織工程研究與臨床康復》雜志社學術部，基因治療及轉基因技術與組織工程〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2010;12(24)：4484-5.

10 Barquinero J，Eixarch H，Perez-Melgosa M.Retroviral vectors：new applications for an old tool〔J〕.Gene Ther，2004;11(Suppl1)：3-9.

Construction of the express system carrying the full length cDNA fragment coding mouse membrane-form klotho protein and its application

LI Bao-Shan，WANG Yan-Jiao，MA Hou-Xun，et al.
Department of Gerontics，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical Unversity，Chongqing 400016，China

Objective To clone the full length of cDNA fragment coding mouse membrane form klotho(mKL)protein and construct the recombinant adeno-associated virus(rAAV)vector carrying the open reading frame(ORF)of the membrane form Klotho protein(pAAV/mKL)and package the virus.The expression of Klotho mRNA and Klotho protein in 7901 cell was tested after rAAV/mKL transfection.Methods The full length of cDNA fragment coding mouse membrane form klotho protein was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).After digestion，ligation and transformation，the targeted cDNA fragment was sub-cloned into pAAVIRES-hnGFP vector in order to construct the recombinant plasmid pAAV/mKL.The pAAV/mKL was verified by restricted digestion and DNA sequencing.Use the AAV-293 cell to package rAAV/mKL and later transfect it into the 7901 cell.Then detect the expression of Klotho by RT-PCR and ELISA.Results The cDNA fragment with 3 064 bp coding membrane form Klotho protein was obtained by PCR amplification，the sequence of it was identical by GenBank.The rAAV/mKL was packaged in AAV-293 cell successfully.After transfection by rAAV/mKL，the expression of Klotho mRNA in 7901 cell was increased，and Klotho protein in the supernate of cultured cells significantly upregulated(P＜0.01).Conclusions The rAAV/mKL carrying the full length of cDNA fragment which coding mouse membrane form klotho protein is successfully constructed and packaged in AAV-293 cells，and transfecting it into the 7901 cell verifies it's function of gene express.All of these will pave a road for the deep research of gene therapy for aging related diseases.

Klotho;Gene clone;Adeno-associated virus;Vector construction;Virus package

R393

〕 A

1005-9202(2012)02-0291-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.02.033

國家自然科學基金面上項目(30672212);重慶市衛生局醫學科研計劃項目(No.2010-2-079)

馬厚勛(1966-)，男，教授，主任醫師，主要從事老年心血管病基礎與臨床。

李寶善(1984-)，男，在讀碩士，主要從事老年心血管病基礎與臨床。

〔2011-08-09收稿 2011-11-17修回〕

(編輯 曹夢園)