HCMV感染對人原代星形膠質細胞IL-6和IL-8表達的影響

王二樸，于向民，李 玲，錢冬萌，王 斌

(青島大學醫學院，山東青島266071)

人巨細胞病毒(HCMV)是造成人類宮內感染導致胎兒中樞神經系統先天性異常的常見病原體。迄今為止，HCMV引起神經系統損傷的機制尚未十分明確。細胞因子是由特定細胞合成、分泌的一類生物活性物質，具有多種生物學作用，如介導和調節免疫應答和炎癥反應，參與炎癥的病理損害等［1］。IL-6是一種多功能的細胞因子，不僅在機體免疫應答、急性反應和造血調控中起重要作用，而且其表達異常會產生多種臨床疾病［2］;IL-8具有炎癥細胞趨化功能并能促其釋放一系列活性產物，導致機體局部的炎癥反應，從而達到殺菌和致異常細胞凋亡的目的［3］。目前，體外實驗證實［4～7］，HCMV 感染本身并不能誘導神經元的凋亡，其凋亡主要存在于染毒星形膠質細胞周圍的未染毒神經元，提示HCMV感染對神經元的損傷并不是由HCMV感染直接造成的，而是通過感染其周圍的星形膠質細胞、影響其旁分泌功能、改變神經元微環境實現的。2010年～2012年，我們以人原代星形膠質細胞為研究對象，觀察HCMV能否感染人原代星形膠質細胞以及感染后對細胞IL-6和IL-8表達的影響，以探討HCMV導致神經系統損傷的致病機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HCMV AD169毒株。人原代星形膠質細胞，人胚肺成纖維細胞。胎牛血清，Trizol試劑，DMEM/F12培養液，膠質纖維酸性蛋白抗體(Anti-GFAP)，鼠抗HCMV即刻早期(IE)蛋白單克隆抗體，異硫氰酸熒光素(FITC)標記兔抗鼠IgG，Thermo Scientific反轉錄試劑盒，FermentasTMGreeen Dream Taq PCR Master Mix(2×)，RIPA裂解液(強)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，兔抗人IL-6多克隆抗體，兔抗人IL-8多克隆抗體，HRP標記羊抗兔IgG，超敏化學發光試劑盒。取自愿行米非司酮流產孕婦的新鮮胚胎(孕8～10周)，其家屬知情同意，由青島市海慈醫院提供。

1.2 HCMV病毒增殖和滴度測定 HCMV在人胚肺成纖維細胞中增殖，待細胞病變至80%以上時收取細胞及培養上清液，－86℃反復凍融3次，使病毒顆粒釋放，1 000 r/min離心10 min，收集上清液作為病毒儲存液，分裝至EP管并保存于－86℃冰箱。通過空斑定量法，確定病毒的感染滴度為5 pfU/cell［8］。

1.3 人原代星形膠質細胞的分離、純化及鑒定75%乙醇消毒人胚胎，仔細剔除血管及軟腦膜，取大腦皮質放入DMEM/F12培養液中，用吸管吹打并收集含單細胞的上清液，離心(800 r/min、5 min)，棄上清液取細胞沉淀，加入DMEM/F12(含10% 胎牛血清)制成細胞懸液，接種于培養瓶中，于37℃、5%CO2的培養箱中培養。每3～5 d換液1次，約8～10 d后細胞鋪滿瓶底。傳代前于37℃ 、250 r/min搖床振蕩過夜后棄掉培養液，以去除神經元、小膠質細胞和少突膠質細胞，用差速貼壁法去除成纖維細胞。連續純化3代。第4代經細胞爬片轉移到圓蓋玻片上培養2～3 d，用免疫熒光法鑒定星形膠質細胞純度。

1.4 細胞培養及分組 對純化的人原代星形膠質細胞進行分組。對照組:正常培養的細胞。感染組:細胞貼壁至培養瓶底部約80%時，加HCMV懸液(5 pfU/cell)，置培養箱中孵育2 h后吸去病毒懸液，加DMEM/F12維持液(含2%胎牛血清)，置37℃、5%CO2孵箱繼續培養，于培養 6、12、24、48、96 h 時用Trizol法收集細胞。因蛋白質表達水平多延遲mRNA表達水平24 h，故用RIPA裂解液(含100 mM的PMSF)裂解收集感染36、48、72、96 h時的細胞總蛋白。

1.5 HCMV感染原代星形膠質細胞模型的鑒定根據 IE mRNA序列設計引物，上游引物:5'-ATGAACCACCCTCCTCTTCC-3'，下游引物:5'-GATATTGCGCACCTTCTCGT-3'，擴增長度為290 bp。分別提取兩組細胞中總 RNA，以隨機引物逆轉錄成cDNA，PCR擴增，檢測IE mRNA。病毒感染3 d后采用免疫熒光方法檢測細胞中IE蛋白。

1.6 兩組IL-6及IL-8 mRNA的檢測 用Triol一步法提取培養各時間點細胞的總RNA，以Oligo(dt)為引物，將RNA逆轉錄為cDNA，特異性引物(表1)PCR擴增，并經1.5%凝膠電泳檢測基因表達，對產物的電泳條帶進行光密度分析，以目的片段與內參灰度比值為其相對表達量。

1.7 兩組IL-6及IL-8蛋白的檢測 采用Westernblot法。用Quantity One圖像分析軟件得到蛋白條帶的灰度面積。將目的蛋白條帶與管家基因內參β-actin蛋白條帶的灰度比值作為目標蛋白的相對表達量。

表1 IL-6及IL-8 mRNA引物序列及擴增片段長度

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。所得數據以ˉx±s表示，行單因素方差分析。各組之間的多重比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代星形膠質細胞純度 分離、純化第4代后的原代星形膠質細胞，免疫熒光染色后在倒置顯微鏡下細胞有較強的綠色熒光。計數200個細胞，原代星形膠質細胞純度達到95%以上。

2.2 兩組細胞形態變化及IE mRNA、蛋白表達對照組:細胞飽滿，具有多個突起，無細胞病變效應(CPE)。感染組:HCMV感染3 d出現CPE，細胞逐漸變圓，伸出的細胞突起回縮，細胞體積增大并且相互融合，5 d后更加明顯，部分細胞甚至從瓶底脫落，懸浮生長一段時間后死亡。感染組在290 bp處可見特異性條帶，大小與IE mRNA的理論大小一致(見圖1)，病毒感染3 d后，感染組細胞核內大量表達IE蛋白。對照組均無IE mRNA、蛋白的表達。HCMV能夠感染人原代星形膠質細胞。

圖1 兩組細胞中IE mRNA表達結果

2.3 兩組IL-6及IL-8 mRNA表達變化 感染組感染后6、12、24 h IL-6 mRNA表達較對照組顯著增加(P 均 ＜0.05)，至48、96 h，表達量大幅下降;對照組IL-8無表達，感染組感染后6、12、24 h IL-8表達量增加(P均 ＜0.05)，48、96 h顯著下調。兩組細胞中IL-6及IL-8 mRNA相對表達量見表2。

表2 兩組IL-6及IL-8 mRNA相對表達量比較(ˉx±s)

2.4 兩組IL-6及IL-8蛋白的表達變化 見表3。對照組IL-6表達很低;感染組36、48 h表達量明顯上調(P 均 ＜0.05)，72、96 h時，其表達量與對照組相近(P均＞0.05)。對照組IL-8蛋白無表達;感染組在感染36、48 h時IL-8蛋白表達量較高(P均＜0.05)，72、96 h 時 IL-8 蛋白表達下降，與對照組相近(P 均 ＞0.05)。

表3 兩組IL-6及IL-8蛋白相對表達量比較(ˉx±s)

3 討論

機體受到細菌或病毒感染時，會激活細胞自身一系列信號通路從而誘導產生一系列對炎癥反應有促進作用的細胞因子，并通過炎癥反應來降低病毒的復制與傳播。這些促細胞炎性因子的表達對于宿主細胞來說是一種有效地抗病毒機制。因此，不難理解HCMV感染初期，隨著病毒的吸附、注入等過程的進行，星形膠質細胞會分泌包括IL-6和IL-8在內的大量細胞因子來應對病毒的侵染，IL-6和IL-8表達水平的增加是病毒直接作用于宿主細胞的結果。病毒感染后期IL-6和IL-8表達下降卻無確切的解釋。

HCMV的基因組是雙鏈DNA，全長＞240 kb，含有至少208個開放閱讀框。病毒感染細胞后，HCMV的基因表達呈現出一定的時序性，分為最早期、早期和晚期。最早期基因被宿主的因子激活并最早表達，產生3種重要的調控蛋白 IE55、IE72、IE86蛋白。IE蛋白是病毒感染細胞后最先合成的蛋白，檢測到IE蛋白意味著HCMV可在細胞內建立感染。

IE72和IE86蛋白是病毒復制和其他基因表達所必須的蛋白。IE86蛋白全長579個氨基酸，是一種糖蛋白，能在體外形成二聚體，其氨基酸功能域位于456 ～539［9］。有學者［10～12］發現，在體外培養的人睪丸上皮細胞中表達HCMV IE86蛋白能夠降低由病毒誘導的β干擾素以及趨化因子等細胞因子的產生。因此我們認為，HCMV感染原代星形膠質細胞后期，由于其自身最早期基因的表達，產生的IE86蛋白抑制了星形膠質細胞中IL-6和IL-8的表達。

HCMV致中樞神經系統損傷的致病機制尚未闡明。已知在中樞神經系統中，神經膠質細胞尤其是小膠質細胞和星形膠質細胞是細胞因子分泌的主要來源。細胞因子在免疫及神經內分泌網絡的連接和調節中起到十分重要的作用。星形膠質細胞是包括HCMV在內的多種嗜神經病毒的主要靶細胞，因此研究HCMV是否激活并引起星形膠質細胞分泌細胞因子改變，將有助于了解HCMV感染的膠質細胞在神經元損傷中所產生的作用。

本研究結果證實人原代星形膠質細胞是HCMV的完全容許細胞(即HCMV能夠在人原代星形膠質細胞建立感染)，且從mRNA、蛋白水平首次證實HCMV感染能夠誘導人原代星形膠質細胞IL-6和IL-8表達異常。對照組中，IL-6表達量很低，IL-8不表達;感染組中，感染初期IL-6和IL-8表達均增加，后期均下調至與對照組相近水平。但是，體外實驗研究多限于單一細胞因子對HCMV感染的作用，體內細胞因子的表達水平受到的調控因素要復雜的多，HCMV感染對體內星形膠質細胞IL-6和IL-8表達的調控作用及其機制以及HCMV致神經系統損傷的機制等尚需進一步深入研究。

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