殼聚糖包裹的多孔聚磷酸鈣生物陶瓷復合兔成骨細胞的實驗研究

郭小凡，范長春，曹學成，蔡錦方

(1山東大學醫學院，濟南250001;2濟南軍區總醫院)

聚磷酸鈣(CPP)是一種無機聚合物，具有生物相容性好、力學強度高、可降解和有骨傳導性等優點［1～4］。在體外實驗研究發現，植入多孔CPP中的軟骨細胞不易骨化并表現出良好的結構和形態［5］。殼聚糖是一種天然聚陽離子多糖，可被動物體內的溶菌酶等降解為氨基葡萄糖而被機體吸收，可以用于骨的重建和組織工程學等［6］。經殼聚糖復合的多孔CPP生物陶瓷具有更好的力學特性和生物相容性［7］。2011年6月～2012年6月，我們將殼聚糖制成殼聚糖微球，涂布于自行加工的多孔CPP生物陶瓷表面，形成殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷，并將其與兔成骨細胞復合，以制作一種能用于骨缺損治療的生物材料。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 成年新西蘭大白兔1只，6個月齡，體質量2.3 kg(由濟南軍區總醫院實驗動物中心提供)。WDW-10電子式萬能力學實驗機(試金集團濟南試驗機廠);倒置顯微鏡 ，電子顯微鏡，O-lympus AU2700型生化監測儀，全自動生化分析儀。磷酸二氫鈣(分析純，天津市博迪化工公司)，殼聚糖粉末(國藥集團化學試劑公司，脫乙酰度≥90%)，DMEM培養基(青島海博生物技術公司)，0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibico公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖微球的制備 采用乳液凝固法合成殼聚糖微粒［8］。將一定量的殼聚糖加入醋酸中溶解后，加入200 mL液體石蠟中，恒溫恒速攪拌，加入適量乳化劑和交聯劑。靜置冷卻后分別采用石油醚、乙醇、去離子水去除石蠟、醋酸等化學物質，得到淡黃色殼聚糖微球。分別過0.45、0.22 mm分子篩后得到所需孔徑的殼聚糖微球。

1.2.2 多孔CPP的制備及結構檢測 采用微球堆積法制備多孔CPP［5］。將一定量的磷酸二氫鈣保溫煅燒10 h后球磨，真空干燥后得到CPP燒料粉末。將粉末加入水及穩定劑、殼聚糖微球，混合后成為料漿。烘干后在高溫下(約950℃)煅燒1 h，得到多孔CPP生物陶瓷。經磨削切割后，在光鏡下觀察其內部貫通情況。用排水法測量多孔CPP的孔隙率。

1.2.3 殼聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的制備將一定量殼聚糖微球加入100 mL的2%醋酸中，加入一定量致孔劑，超聲混勻后涂布于CPP生物陶瓷表面，干燥后以氫氧化鈉溶液去除其內的醋酸，丙酮除去致孔劑，得到殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷。

1.2.4 殼聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的生物力學檢測 將CPP生物陶瓷以機器切割成為15 mm×4 mm×4 mm的長方體(后續實驗均以該尺寸進行)，將其置入WDW-10電子式萬能力學實驗機上進行力學測試，檢測其各方向受壓形變程度以及垂直抗壓強度。共測試11個試樣(其中1個在后續實驗中用于掃描電鏡拍照)，取均值。

1.2.5 兔成骨細胞的誘導及鑒定 抽取兔骨髓10 mL，加入DMEM標準培養基20 mL，懸液經100目不銹鋼網過濾后，接種于2個50 mL培養瓶中，在5%CO2、37℃孵箱內培養，每隔2 d換液1次，前3次半量換液，以后采用全量，同時棄去紅細胞等未貼壁細胞。約2周得到貼壁生長的單層骨髓間充質干細胞(BMSC)。待其接近融合時，用胰蛋白酶、EDTA消化，一分為二傳代。取體外傳代培養的第3代BMSC，將其分至11個培養瓶的培養基中(其中1個在后續實驗用于掃描電鏡拍照)。分別在11個DMEM培養基中加入誘導劑(地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、胎牛血清)使其向成骨細胞分化。將接種有成骨細胞的蓋玻片用多聚甲醛固定，行HE染色光鏡形態觀察并進行堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定。

1.2.6 成骨細胞與殼聚糖包裹的多孔CPP生物陶瓷的復合方法 將已經制備完成的殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷進行γ射線消毒后，分別放入成功分化的11組成骨細胞中，使成骨細胞與殼聚糖包裹的CPP陶瓷復合。培養至第6天時，取出其中1組多孔CPP生物陶瓷，PBS沖洗3遍，2%戊二醛固定，丙酮脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，表面噴金后，掃描電鏡觀察陶瓷表面形態及成骨細胞生長情況。培養至第9天時，取出剩余10組CPP生物陶瓷，倒置相差顯微鏡下動態觀察成骨細胞形態和生長情況。在CPP生物陶瓷放入培養基后的第0、3、6、9天，用Olympus AU2700型生化監測儀檢測細胞培養液中的ALP水平，用全自動生化分析儀檢測Ca2+和PO3－4含量。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。數據用ˉx±s表示，用OneWay ANOVA分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多孔CPP生物陶瓷形態觀察及包裹殼聚糖后的生物力學性能測試 光鏡下，可見CPP陶瓷各部分性狀均一，孔徑的分布較為均勻。經磨削切割后光鏡觀察見其內部成孔良好、均勻，貫通性較好，見圖1。孔隙率為(46.2±0.6)%。殼聚糖微球為淡黃色分布均勻的顆粒，微球粒徑約200～400 μm。殼聚糖膜包裹后的多孔CPP生物陶瓷負荷—形變曲線見圖2，其抗壓強度為400 MPa。

圖1 多孔CPP生物陶瓷內部結構(光鏡，×500)

2.2 成骨細胞的鑒定 成功分離培養出兔BMSC，并誘導成為成骨細胞。HE染色光鏡下見細胞有多邊形、三角形、長梭形、星形等，有多個大小不一、互相連接的樹狀突起并與周圍細胞形成連接，胞核呈橢圓形，略嗜堿性，細胞質內含有較多顆粒，具有較典型的成骨細胞形態。ALP染色見細胞質內存在中等量黑色物質，說明BMSC已分化為成骨細胞，分泌ALP。

圖2 多孔CPP生物陶瓷負荷—形變曲線

2.3 成骨細胞與殼聚糖膜包裹的CPP生物陶瓷復合情況

2.3.1 復合后細胞培養液中ALP的變化 各組細胞培養液第0、3、6、9天的ALP依次增高，分別為0、(20.0 ±2.94)、(28.9 ±1.66)、(36.2 ±4.14)μL，P均＜0.01，成骨細胞在殼聚糖膜包裹的多孔CPP生物陶瓷上生長過程中所產生的ALP逐漸升高。

2.3.3 復合后成骨細胞形態和生長情況 電鏡檢查示成骨細胞與殼聚糖膜包裹的CPP生物陶瓷復合良好，在CPP內部的孔隙中，成骨細胞分布均勻，能在殼聚糖包裹的CPP內表面正常生長增殖并分泌細胞外基質，見圖3。

圖3 復合成骨細胞后殼聚糖包裹的CPP表面形態(電鏡，×2 000)

3 討論

殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷是當前骨組織工程學研究的重點。作為兩種材料——殼聚糖與CPP的復合體，它集合了兩者對促進骨骼修復的諸多優點。多孔CPP可以作為整個生物陶瓷的支架，是整個骨骼力學撐重的支架，實驗中該生物陶瓷抗壓強度達到400 MPa，遠超過同等情況骨皮質的抗壓程度［9］，提示該生物陶瓷的強度足以替代骨骼，同時它也通過內部分布均勻的孔道為成骨細胞的生長及分泌基質提供了一個三維空間支架。包裹在多孔CPP之上的殼聚糖則扮演了生物相容性外衣的角色，具有止血、抗感染、可塑性和黏附性好等優點，可以幫助修復材料植入生物體內后與機體反應更加溫和。

本研究所制備的 CPP孔隙率約為(46.2±0.6)%，內部結構良好，孔隙分布均勻，貫通性好，有利于成骨細胞生長。另一方面，CPP的分解產物(Ca2+、PO3－4)是成骨細胞合成骨質的必需原料，也有助于骨骼合成。在本研究中，我們對成骨細胞培養液中的Ca2+和PO3－4進行了檢測，由于實驗中沒有向培養液中加入鈣離子與磷離子，而且CPP中的鈣磷溶于水的量極少，可以忽略，因此第0天細胞培養液中并未檢測到鈣磷離子，而第3、6、9天時Ca2+和PO3－4的濃度為0.5～2 mmol/L，提示鈣磷離子是由成骨細胞分解CPP產生的，不但證明CPP可以為成骨細胞生長提供必需原料，也說明與殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷復合后的成骨細胞活性良好，具有分解CPP的能力。至于鈣磷含量的無規律上下波動可能是由于不同培養瓶中的成骨細胞生長速度、代謝水平不相同，使得它們利用鈣磷以及分解CPP的速率不同而致，也可能是由于不同培養瓶中殼聚糖包裹的CPP表面積(包括其內部孔隙的面積)不同使得成骨細胞總分解速率不同所致。

BMSC是一類具有自我復制能力以及分化潛能的干細胞，通過改變其誘導環境，能夠使其分化成為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞等多種細胞。BMSC的另一優勢是可以隨時直接從活體取材而不影響供體健康，這就提供了將復合這種細胞的生物陶瓷應用到人類骨缺損治療中的臨床可行性。本研究中，我們通過對細胞培養液中的ALP、進行檢測，并用掃描電鏡對成骨細胞進行形態學觀察，評估BMSC誘導出的成骨細胞與殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷復合的生物相容性。ALP是成骨細胞分化和功能的標志。研究表明，骨組織中發生鈣化的部位有ALP活性，說明ALP與骨組織的鈣化過程有關。因此，ALP的檢測能夠反映成骨細胞在生物陶瓷上的生長情況及有無骨質合成。本研究結果顯示，第0、3、6、9天細胞培養液中的ALP逐漸升高，說明成骨細胞功能良好并且進行了骨質合成。之前討論已論述，的出現提示成骨細胞對多孔CPP具有分解作用，證明了成骨細胞活性良好，并且處于分泌基質所必需的原料)充足環境之中。電鏡下可見在包裹殼聚糖多孔CPP的孔道內，成骨細胞較均勻地生長于其內，形態良好，并且可見細胞外基質，提示成骨細胞可以正常地在這種生物陶瓷上生長。

本實驗是在體外環境中進行的，而生物體的內環境含有非常復雜的生物環境，是體外實驗無法模仿的，因此復合有成骨細胞的殼聚糖包裹的CPP生物陶瓷在生物體內的功能表現尚需進一步研究。

［1］Pilliar RM，Filiaggi MJ，Wells JD，et al.Porous calcium polyphosphate scaffolds for bone substitute applications——in vitro characterization［J］.Biomaterials，2001，22(9):963-972.

［2］Kandel RA，Grynpas M，Pilliar R，et al.Repair of osteochondral defects with biphasic cartilage-calcium polyphosphate constructs in a sheep model［J］.Biomaterials，2006，27(22):4120-4131.

［3］Qiu K，Zhao XJ，Wan CX，et al.Effect of strontium ions on the growth of ROS17/2.8 cells on porous calcium polyphosphate scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27(8):1277-1286.

［4］ Grynpas MD，Pilliar RM，Kandel RA，et al.Porous calcium polyphosphate scaffolds for bone substitute applications in vivo studies［J］.Biomaterials，2002，23(9):2063-2070.

［5］Pilliar RM，Filiaggi MJ，Wells JD，et al.Porous calcium polyphosphate scaffolds for bone substitution applications-in vitro characterization［J］.Biomaterials，2001，22(9):963-972.

［6］Park CJ，Gabrielson NP，Pack DW，et al.The effect of chitosan on the migration of neutrophil-like HL60 cells，mediated by IL-8［J］.Biomaterials，2009，30(4):436-444.

［7］Xu HH，Simon CG Jr.Fast setting calcium phosphateechitosan scaffold:mechanical properties and biocompatibility［J］.Biomaterials，2005，26(12):1337-1348.

［8］馬曉莉，姚子華，徐偉偉.多孔殼聚糖膜的制備及性能表征［J］.功能高分子材料，2005，23(3):434-440.

［9］Cowin SC.Bone Mechanics Handbook［M］.2nd.Boea Raton:CRC Press，2001:105-109.