阻斷腎素—血管緊張素—醛固酮系統不同環節對肝纖維化大鼠肝組織的影響

焦占江，周 杰，崔忠林，錢建平，曾德華

(1南方醫科大學南方醫院，廣州510515;2福州軍區總醫院)

肝纖維化是諸多肝病共同的病理改變。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(RAAS)在肝纖維化形成中起著重要的作用。RAAS除了存在于循環系統中外，還存在于許多組織器官中，如心、腎、肺、胰、肝等［1］。研究表明［2］，肝內 RAAS 參與肝纖維化的發展。2011年～2012年，我們通過研究阻斷RAAS不同環節對肝纖維化大鼠肝組織的影響，從病理學角度探討拮抗RAAS不同環節抗肝纖維化的實驗依據。現將相關研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 ①藥品及主要試劑:氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司產品)，卡托普利片(湖南湘雅制藥有限公司產品)，螺內酯片(杭州民生藥業集團有限公司產品);Masson三色染色試劑盒購于福建邁新生物技術開發有限公司。②實驗動物:6周齡清潔級SD大鼠(福建醫科大學動物實驗中心提供)50只，雌雄不拘，體質量180～220 g，室溫18～25℃，濕度30% ～50%，精制飼料喂養。

1.2 動物分組、模型制備及用藥 將50只大鼠按隨機區組設計分為正常組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組和螺內酯組，各10只。正常組皮下注射橄欖油，余大鼠予40%CCl4腹壁皮下注射，3 mL/kg，首劑加倍，1次/3 d，復制大鼠肝纖維化模型;次日，卡托普利組用血管緊張素轉換酶抑制劑卡托普利60 mg/kg、氯沙坦組用血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體阻斷劑氯沙坦10 mg/kg、螺內酯組用醛固酮受體拮抗劑螺內酯100 mg/kg(均用10 mL生理鹽水稀釋后)灌胃，模型組和正常組用10 mL生理鹽水灌胃，均1次/d，于第8周處死所有動物，取右肝組織，液氮保存，備測。

1.3 觀察指標 ①觀察大鼠體質量、精神、飲食、活動、死亡等一般情況。②肝組織病理學改變:肝組織用10%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，5 μm厚連續切片，行HE和Massion染色。行 Kondell評分［3］并對肝纖維化程度進行分級，0級:無纖維化;1級:匯管區纖維化;2級:匯管區纖維化擴大;3級:橋接樣纖維化;4級:肝硬化。采用Image-pro計算機圖像分析軟件測定肝膠原面積，計算其占視野總面積的百分比，測6次，取均值為肝纖維化面積比。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件。數據以ˉx±s表示，計量資料比較采用方差分析，計數資料采用秩和檢驗。P≤0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物一般狀態 正常組大鼠精神良好，毛色光澤，運動活潑，反應敏銳，進食、飲水正常，體質量增加;模型組大鼠精神萎靡，活動少，反應遲鈍，進食、飲水少，體質量下降明顯;卡托普利組、螺內酯組、氯沙坦組大鼠精神、活動、反應、飲食、體質量均較模型組好。

2.2 肝組織病理變化 HE染色:正常組見肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，結構完整;模型組肝細胞索排列紊亂，肝細胞呈彌漫性脂肪變性，空泡形成，匯管區擴大，匯管區和肝小葉內可見淋巴細胞浸潤，假小葉形成;卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組見肝細胞壞死及空泡變性減少，淋巴細胞浸潤減少。Masson染色:正常組膠原纖維在血管周圍少量表達;模型組膠原纖維增生明顯，纖維間隔形成，可見弓形纖維，部分區域形成假小葉;卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組膠原纖維減少，形成的纖維間隔和假小葉明顯減少。各組大鼠肝纖維化程度分級比較見表1，肝纖維化面積比、Kondell評分比較見表2。

表1 各組肝纖維化大鼠肝纖維化程度分級(例)

表2 各組肝纖維化面積比、Kondell評分比較(ˉx±s)

3 討論

肝纖維化是肝細胞肝癌的危險因素之一［4］。不同病因(如病毒、乙醇、寄生蟲、銅鐵沉積等)引起的慢性肝損傷最終會導致以膠原為主的細胞外基質(ECM)各成分合成增多，降解相對不足，過多沉積在肝內，引起肝纖維化［4，5］。肝纖維化的特征不僅是肝組織中基質蛋白濃度的增加，包括膠原、彈力蛋白、結構糖蛋白、蛋白多糖及透明質酸，而且是基質成分的改變。其中，肝星狀細胞是肝纖維化過程中生成纖維的主要細胞。在正常肝組織中，肝星狀細胞主要用來儲存維生素A［5］。受傷后，肝星狀細胞激活轉變為肌成纖維細胞，能產生一系列的促纖維化、促炎癥反應的細胞因子和化學因子，也能產生纖維組織的ECM成分，在肝纖維化的發生發展中起著關鍵性的作用。

RAAS是機體調節血管張力和鈉水代謝的內分泌系統。器官和組織也能合成RAAS的全部或大部分成分，稱為局部RAAS，其主要與組織纖維化和(或)重構過程有關，如心肌梗死后纖維化、心肌肥厚、腎纖維化和皮膚纖維化等。肝臟亦存在局部RAAS。研究表明［1］，隨著肝臟的受損，可觀察到RAAS的成分如血管緊張素原、腎素、血管緊張素轉換酶、血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ的上調或重新分布。局部組織RAAS在組織纖維的形成中具有重要的促進作用，其效應分子血管緊張素Ⅱ和醛固酮是重要的致炎因子，可促進成纖維細胞增殖和ECM的合成［6］。亦有研究表明，RAAS的主要活性物質血管緊張素Ⅱ和醛固酮作用于肝星狀細胞，通過激活轉化生長因子(TGF)-β1、血小板衍生因子(PDGF)等細胞因子或直接促進肝星狀細胞分裂增生、分泌ECM等機制，促進纖維化的發生［7］。人體和動物實驗表明，與對照組比較，肝硬化組內血漿腎素濃度和活性以及它的作用底物血管緊張素原的濃度和活性都有所增加［8］。血管緊張素Ⅱ在正常動物中既存在于血漿又可存在于肝組織中，在鼠肝病模型和肝硬化患者中，血管緊張素Ⅱ含量顯著增加［9］。血管緊張素Ⅱ是肝纖維化形成的主要介質之一，它既參與了炎癥細胞的聚集［10］，又參與了肝星狀細胞活化表型的轉變［1］。醛固酮是纖維化的重要發病因素［11］。研究表明，醛固酮作用于肝星狀細胞株HSC-T6 48 h后可以促進Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及組織金屬蛋白酶抑制因子的表達(呈劑量依賴性)，發揮促肝纖維化的作用［12］。

近年認識到肝纖維化甚至肝硬化在去除病因、經過恰當治療后可能逆轉［13］。雖然RAAS系統在肝病中的作用還沒有被完全闡明，但RAAS可能是抗肝纖維化治療的潛在靶點。

CCl4誘導的肝纖維化動物模型在形態學、病理生理學某些方面與人肝纖維化相似［14］。本實驗運用CCl4誘導制備大鼠肝纖維化模型，病理學檢查顯示，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組肝纖維化程度高于正常組;卡托普利組、氯沙坦組和螺內酯組肝纖維化程度相近，均較模型組明顯減輕，提示阻斷RAAS不同環節對肝纖維化大鼠具有相同的抑制肝纖維化的作用。

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