膀胱移行細胞癌術后復發與染色體畸變的相關性研究

張婷婷，李錦毅

(1遼寧醫學院，遼寧錦州121001;2中國武警總醫院)

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，90%為膀胱移行細胞癌(TCCB)，具有多中心起源及易復發、反復發作等特點。膀胱癌術后2年復發率達70% ～80%［1］。如何有效地預防和檢測膀胱癌術后復發，是提高患者生存質量的關鍵和迫切需要解決的難題。有文獻報道，與膀胱癌復發的相關染色體主要有3、5、7、9、11、17 號染色體［2］。為了探討TCCB術后復發與染色體畸變的關系，2011年1月～2012年1月，我們分析了3、7、17號染色體及9號染色體p16基因位點的畸變與TCCB術后復發的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集中國武警總醫院TCCB組織石蠟標本35例，均經病理證實。35例患者中，男20例、女15例，平均年齡63歲。均行經尿道膀胱腫瘤電切術，其中術后未復發16例;復發19例，初次復發10例，復發2次或超過2次者9例。19例復發性TCCB中，根據2002年美國癌癥聯合委員會癌癥分期標準進行分期，Ta～T112例，T2～T47例;根據2004 年 WHO TCCB 分級標準，G1級9 例，G2～3級10例。另選10例TCCB癌旁正常組織為對照。

1.2 主要儀器與試劑 熒光顯微鏡、相應的濾光片組及分析軟件(日本Olympus公司生產)，膀胱癌細胞染色體及基因異常檢測試劑盒(購自北京金菩嘉醫療科技有限公司)，胃蛋白酶。

1.3 TCCB組織中3、7、17號染色體及9號染色體p16基因的檢測方法 采用熒光原位雜交技術(FISH)檢測。所有標本用10%甲醛固定8～24 h，石蠟包埋，3～4 μm厚切片。脫蠟2次，組織切片經酶消化、脫水。自然干燥玻片。將10 μL(雜交緩沖液8 μL+探針2 μL)的探針混合物滴加于玻片雜交區域，用橡皮膠封邊。放入濕盒雜交。暗處自然干燥玻片。將20 μL的4，6-聯瞇-2-苯基吲哚(DAPI)復染劑滴加于雜交區域位置，立即蓋上蓋玻片。完成雜交。

結果判定:采用熒光顯微鏡觀察，電荷耦合設備相機攝取圖像，FISH 2.0軟件處理。每組探針組合分析100個細胞，選擇雜交信號均勻、清晰的細胞進行計數，統計異常細胞畸變的百分比。TCCB組織中正常染色體表現為紅、綠色信號(各為2個)，如多于或少于2個信號，即為發生染色體畸變。

依據北京金菩嘉醫療科技有限公司推薦的方法，建立10例癌旁正常組織中3、7、17號染色體及9號染色體p16基因位點畸變閾值(閾值=ˉx+3×s)。見表1。如檢測值＞閾值，則判定為陽性;如檢測值＜閾值，判定為陰性;如檢測值=閾值，則增加樣本細胞的數量。如該樣本僅1個探針出現異常，提示該樣本FISH結果為陰性;如出現兩個以上異常或同一異常多次出現，則為FISH結果陽性。

表1 癌旁正常組織中各染色體畸變閾值(%)

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0軟件，計數資料用四格表Fisher確切概率法，相關性分析采用兩分類變量的關聯性分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCCB組織中染色體畸變率 19例復發性TCCB組織中，3、7、17號染色體及9號染色體p16基因的畸變率分別為 42.11%、57.89%、84.21%和89.47%;16例未復發性TCCB中分別為31.25%、37.50%、43.75%和 50.00%，復發者的 17 號染色體和9號染色體p16基因的畸變率與未復發者比較，P均＜0.05。在復發性TCCB中，17號染色體畸變主要表現為多倍體，占57.89%，9號染色體p16基因主要表現為缺失，占68.42%。

2.2 染色體畸變與TCCB臨床病理指標的關系17號染色體和9號染色體p16基因位點的畸變與TCCB復發有關(P＜0.05);復發性TCCB的 G1級與G2～3級組織中7號染色體畸變率差異有統計學意義(P＜0.05)，各染色體畸變率與TCCB病理分期、復發次數無關(P均＞0.05)。見表2。

表2 染色體畸變與TCCB臨床病理指標的關系

2.3 染色體畸變與TCCB復發及組織分級的相關性 17號染色體和9號染色體p16基因位點畸變率與TCCB復發呈正相關(r分別為0.391和0.399，P均＜0.05);7號染色體畸變率與復發性TCCB組織分級呈正相關(r=0.565，P ＜0.05)。

3 討論

TCCB發生發展過程中存在基因的缺陷和染色體異常，且復發與染色體畸變有關［2］。研究結果表明［3］，FISH 陽性低風險患者的復發風險比為 1.6，高風險患者的復發率更高，復發風險比為1.9。膀胱癌復發與染色體畸變具有相關性，畸變率越高，復發的風險越大。

FISH主要用于檢測染色體數目異常和結構的畸變，其基本原理是用已知標記的單鏈核酸為探針，按照堿基互補原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。FISH探針具有穩定、操作安全等優點，在染色體定性定量檢測中能通過堿基互補保證反應的特異性。因此我們采用該技術，利用3、7、17號染色體著絲粒探針和9號染色體p16基因位點探針檢測TCCB組織中染色體異常的情況，并分析其畸變與TCCB術后復發的相關關系。

本研究發現，在TCCB復發與未復發組織中17號染色體和9號染色體p16基因畸變差異有統計學意義(P均＜0.05)，且呈正相關關系，說明TCCB術后復發與17號染色體和9號染色體p16基因的畸變密切相關。后兩者有可能成為TCCB早期診斷及術后檢測復發的重要分子標志物。

研究表明，TCCB復發與染色體畸變的嚴重程度及腫瘤分級有關［4］。本研究結果顯示，在復發性TCCB的G1級與G2～3級組織中7號染色體畸變差異顯著(P＜0.05)，G2～3級組織中 7號染色體畸變率明顯高于G1級，說明染色體畸變可促進TCCB發生發展。

p16基因定位于人類的第9號染色體短臂2區1帶(9p21)，其表達產物p16蛋白直接參于細胞分裂增殖的負性調控［5］，9p21位點的缺失在膀胱癌的早期時常發生［6］，9號染色體單倍體的發生是復發性膀胱癌的早期事件，9號染色體的缺失被認為是膀胱癌發生的啟動標志［7，8］。p16基因的缺失被認為是腫瘤復發的獨立因素［8］。本研究中，9號染色體p16基因的畸變與TCCB復發呈正相關關系(P＜0.05)。在復發性TCCB組織中，9號染色體p16基因畸變率高達89.47%，明顯高于未復發性TCCB的50.00%，且主要表現為染色體缺失，提示TCCB術后復發與9號染色體p16基因的畸變密切相關，尤其是p16基因的缺失，為判斷TCCB預后提供了重要的依據。

研究發現［9，10］，17 號染色體多倍體的出現與膀胱癌的復發有關，可以作為檢測膀胱癌復發的指標。本研究中，在復發性TCCB組織中17號染色體多倍體占57.89%，說明復發性TCCB中17號染色體異常主要表現為多倍體。與以上研究結果相符。在復發性TCCB組織中17號染色體畸變率(84.21%)明顯高于未復發性 TCCB(43.75%)，且其畸變與TCCB術后復發呈正相關關系，說明17號染色體畸變對檢測TCCB術后復發有重要的臨床價值。

綜上，TCCB術后復發與其染色體畸變有關，特別9號染色體的p16基因及17號染色體畸變，可以作為預測TCCB術后復發的檢測指標。

［1］Amira N，Mourah S，Rozet F，et al.Non-invasive molecular detection of bladder cancer recurrence［J］.Int J Cancer，2002，101(3):293-297.

［2］喬忠杰，王國民.膀胱癌復發與染色體畸變關系的研究進展［J］.國外醫學:腫瘤學分冊，2005，25(2):167-169.

［3］肖蘭，楊繼洲，康照利，等.熒光原位雜交在膀胱尿路上皮癌中的應用［J］.腫瘤防治研究，2011，38(3):302-304.

［4］Savic S，Zlobec I，Thalmann GN，et al.The prognostic value of cytology and fluorescence in situ hybridization in the follow-up of nonmuscle-invasivebladdercancerafterintravesicalBacillus Calmette-Gu?rin therapy［J］.Int J Cancer，2009，124(12):2899-2904.

［5］Simon R，Burger H，Brinkschmidt C，et al.Chromosomal aberrations associated with invasion in papillary superficial bladder cancer［J］.Pathol，1998，185(4):345-351.

［6］Knowles MA.Bladder cancer subtypes defined by genomic alterations［J］.Scand J Urol Nephrol Suppl，2008，(218):116-130.

［7］Kimura F，Florl AR，Seifert HH，et al.Destabilization of Chromosome 9 in transitional cell carcinoma of the urinary bladder［J］.Br J Cancer，2001，85(12):1887-1893.

［8］Kawauchi S，Sakai H，Ikemoto K，et al.9p21 index as estimated by dual-color fluorescence in situ hybridization is useful to predict urothelial carcinoma recurrence in bladder washing cytology［J］.Hum Pathol，2009，40(12):1783-1789.

［9］Simonetti S，Russo R，Ciancia G，et al.Role of polysomy 17 in transitional cell carcinoma of the bladder:immunohistochemical study of HER2/neu expression and FISH analysis of c-erbB-2 gene and chromosome 17［J］.Int J Surg Pathol，2009，17(3):198-205.

［10］Kruger S，Mess F，Bohle A，et al.Numerical aberrations of chromosome 17 and the 9p21 locus are independent predictors of tumor recurrence in non-invasive transitional cell carcinoma of the urinary bladder［J］.Int J Oncol，2003，23(1):41-48.