姜黃素對卵巢癌細胞凋亡的影響

楊海霞

(1青島大學醫學院，山東青島266003;2青島市黃島區中醫醫院)

卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤，其發生是多基因多因素相互作用的過程［1］，其中表皮生長因子受體(EGFR)是目前研究最多的基因之一［2］。姜黃是一種常用中藥，其主要有效成分是姜黃素，具有多方面的藥理作用［3］，美國國立腫瘤所已將其列為第3代抗癌化學預防藥［4］。2011年1月～2012年1月，我們將姜黃素作用于人卵巢癌細胞株SKOV3，觀察姜黃素作用前后SKOV3中EGFR的表達變化，檢測細胞周期及凋亡情況，探討姜黃素對人卵巢癌細胞的影響及作用機制，為卵巢癌的藥物治療提供新思路。現將相關研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 人卵巢癌細胞株SKOV3購自廣西醫科大學附屬腫瘤醫院;胎牛血清購于中美合資蘭州民海生物工程有限公司，姜黃素為Sigma公司產品，RT-PCR逆轉錄盒購于北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 細胞培養及分組 SKOV3常規培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱內，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。將細胞隨機分為空白組、順鉑組(加入終濃度為2.5 μmol/mL的順鉑)、姜黃素組(加入終濃度為10 μmol/mL的姜黃素)、聯合組(加入順鉑 2.5 μmol/mL和姜黃素 10 μmol/mL)，均作用24 h。

1.3 細胞形態學觀察 用倒置光學顯微鏡觀察藥物作用前后細胞形態的變化。

1.4 各組EGFR的檢測 采用RT-PCR法。用Trizol一步法提取細胞中總RNA，按逆轉錄試劑盒操作要求合成cDNA，進行PCR擴增。擴增條件:94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共25個循環，72℃延伸10 min。行瓊脂糖凝膠電泳，以β-action作為內參照，用 Band Scan圖像分析軟件對結果進行分析。EGFR上游引物:5'-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3';EGFR下游引物:5'-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3'。以目的基因擴增條帶的平均灰度與β-actin比值為EGFR相對表達量。

1.5 各組細胞凋亡率的測算 藥物作用細胞24 h后，將各組細胞用胰酶消化，收集細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，用PBS洗滌2遍，置于-20℃預冷的75%乙醇中固定18 h，采用流式細胞術測算各組細胞凋亡率。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，數據以ˉx±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態變化 空白組細胞貼壁生長良好，細胞呈多邊形或梭形，輪廓清楚，核大，核仁顏色較深，胞質透亮;順鉑組、姜黃素組貼壁細胞數量減少，細胞變圓，體積變小，胞質透亮度下降，部分細胞可見細胞碎片;聯合組細胞數量減少明顯，細胞體積明顯縮小，細胞膜崩潰，核固縮，細胞周圍可見凋亡小體。

2.2 各組EGFR表達情況 見圖1。空白組、順鉑組、姜黃素組、聯合組EGFR相對表達量分別為5.89± 0.04、3.41 ±0.12、3.67 ±0.31、1.69 ±0.07。與空白組比較，其他三組EGFR相對表達量均降低(P均＜0.01);聯合組EGFR相對表達量低于順鉑組和姜黃素組(P均＜0.05);順鉑組與姜黃素組EGFR相對表達量相近(P＞0.05)。

圖1 各組細胞EGFR表達情況

2.3 各組細胞周期及細胞凋亡率 見表1。由表1得知，與空白組比較，順鉑組、姜黃素組、聯合組細胞凋亡率和G0/G1期細胞均增高，G2/M期細胞降低(P均＜0.05)。與順鉑組、姜黃素組比較，聯合組細胞凋亡率和G0/G1期細胞增高、G2/M期細胞降低(P均＜0.05)。順鉑組與姜黃素組細胞凋亡率及G0/G1期細胞相近(P均＞0.05)。

表1 各組細胞周期及細胞凋亡率(%，ˉx±s)

3 討論

因缺乏典型的臨床表現及早期篩查方法，60%～70%的卵巢癌患者就診時病灶已屬晚期，5年生存率在30%左右［5］。目前對卵巢癌的治療原則是以手術為主，輔以化療等綜合治療，但腫瘤細胞的耐藥成為臨床治療的障礙，加之化療不良反應使部分患者痛苦不堪，因此探索安全有效的抗卵巢癌藥物是目前研究熱點。

姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種植物多酚，近年來研究發現［6］，姜黃素不僅具有抗氧化、抗感染、降血脂的作用，還可以抑制多種腫瘤(如神經膠質瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、卵巢癌)細胞增殖，促進其凋亡［7，8］。有學者［9，10］研究認為姜黃素能通過抑制NF-κB的活性及阻滯細胞周期來有效地抑制卵巢癌細胞的增殖;通過抑制卵巢癌細胞survivin基因的表達，促進其瘤細胞凋亡。本研究結果顯示，姜黃素能有效促進卵巢癌細胞凋亡，下調癌細胞中EGFR的表達。

姜黃素主要通過以下途徑起抗腫瘤作用:①通過內外源性途徑誘導腫瘤細胞凋亡，一方面姜黃素能夠下調卵巢癌細胞中Bcl-2、蛋白激酶 B(AKT)的表達，同時激活 p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，通過p53非依賴途徑誘導卵巢癌細胞凋亡［11］;另一方面還可以通過線粒體依賴途徑誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期于G0/G1期［12］;②姜黃素還可以抑制AKT及MAPK信號傳導通路，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移;③姜黃素可能是通過下調腫瘤血管內皮細胞生長因子(VEGF)等促進血管形成蛋白，抑制腫瘤血管形成，促進腫瘤壞死［13］。

EGFR是原癌基因的表達產物，具有酪氨酸蛋白激酶活性，與相應配體結合后，可啟動細胞生長周期，導致DNA合成增加，刺激各種細胞生長和增殖。有研究表明［14，15］，卵巢癌組織中 EGFR 呈高表達，其與病理分級和臨床分期密切相關。根據本研究結果我們認為，姜黃素有效促進卵巢癌細胞凋亡的作用與其能下調細胞中EGFR表達有關。與單獨用藥比較，姜黃素聯合順鉑的抑瘤作用明顯增強。

［1］劉從容，鄭文新.卵巢癌發生機制研究進展［J］.中華病理學雜志，2011，40(8):569-572.

［2］Koutchi N，Yasumasa K，Takahide T，et al.Heterozygous mutation(G/G→G/A)at nt 2607 of the EGFR gene is closely associated with increases in EGFR copy number and mRNA half life，but impaired EGFR protein synthesis in squamous cell carcinomas of the head and neck-implication for gefitinib efficacy［J］.Oncol Lett，2010，1(6):1017-1020.

［3］Minnie M，Mirian M，Mark P，et al.Curcumin，a nutritional supplement with antineoplastic activity，enhances leiomyoma cell apoptosis and decreases fibronection expression［J］.Fertil Steril，2009，91(5):2177-2184.

［4］Odot J，Albert P，Carlier A，et al.In vitro and in vivo anti-tumoral effect of cumumin against melanoma cells［J］.Int J Cancer，2004，11(3):381-387.

［5］Harries M，Kaye SB.Recent advances in the treatment of epithelial ovarian cancer［J］.Expert Opin Investig Drugs，2001，10(9):1715-1724.

［6］Jing Z，Yong Z，Yan Z，et al.Anti-tumor effect of curcumin on human cervical carcinoma HeLa cells in vitro and invivo［J］.Chinese J Cancer Res，2007，19(1):32-36.

［7］Aoki H，Takda Y，Kondo S，et al.Evidence that curcumin suppresses the growth of malignant gliomas in vitro and in vivo through induction of autophagy:role of Akt and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways［J］.Mol Pharmacol，2007，72(1):29-39.

［8］Tomita M，Kawakami H，Uchihara JN，et al.Curcumin(diferuloylmethane)inhibits constitutive active NF-kappaB，leading to suppression of cell growth of human T-cell leukemia virus type I-infected T-cell lines and primary adult T-cell leukemia cells［J］.Int J Cancer，2006，118(3):765-772.

［9］李帆，馬向東，陳必良，等.姜黃素阻斷NF-κB信號通路抑制人卵巢癌細胞株3AO增殖［J］.現代腫瘤醫學，2010，18(6):1077-1080.

［10］霍森燁，史小榮.姜黃素對人卵巢癌細胞株SKOV-3增殖和凋亡的影響［J］.中國藥物與臨床，2011，11(4):406-408.

［11］Watson JL，Greenshields A，Hill R，et al.Curcumin-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells is p53-independent and involves p38 mitogen activated protein kinase activation and down regulation of Bcl-2 and suivivin expression and AKT signaling［J］.Mol Carcing，2010，49(1):13-24.

［12］Reuter S，Eifes S，Dicato M，et al.Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76(11):1340-1351.

［13］Bhandarkar S，Arbiser JL.Curcumin as an inhibitor of angiogenesis［J］.Adv Exp Med Biol，2007，595(6):185-195.

［14］陳愛平，楊蕊蕊，張紅玲，等.EGFR、VEGF及 LRP mRNA在卵巢上皮性癌組織中的表達及其意義［J］.現代婦產科進展，2008，17(10):748-751.

［15］Psyrri A，Kassar M，Yu Z，et al.Effect of epidermal growth factor receptor expression level on survival in patients with epithelial ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(12):8637-8643.