p53異構體和MDM2、PTEN在胃癌組織中表達的相關性

孫 娜，季萬勝，劉俊衡，劉丹丹，高志星

(濰坊醫學院，山東濰坊261041)

胃癌是指起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，目前認為胃癌的發生發展是多環節、多因素、多基因相互作用的結果。p53抑癌基因功能的失活在胃癌的發生發展過程中起重要作用。但最近的統計數據表明，中國內地胃癌 p53的突變率為30.6%［1］，提示部分胃癌的發生并沒有伴隨著p53的高突變率。研究顯示，p53的生物化學和生物學功能是可以通過p53異構體和全長p53蛋白之間的相互作用來調節的。因此，研究p53異構體在胃癌組織中的表達模式、異構體對野生型p53功能的影響、特別是對p53下游分子表達水平的影響，有可能發現胃癌發生的新機制。我們采用PCR、免疫組化方法檢測了胃癌組織和癌旁胃組織中 p53異構體、雙微基因2(MDM2)、同源性磷酸酶張力蛋白(PTEN)的表達情況，并探討其在胃癌發生、發展中的作用及它們之間的相互關系，為胃癌的早期和臨床診斷提供更多的新思路和新方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年11月～2011年2月于濰坊醫學院附屬醫院普外科行胃癌根治術的30例胃癌患者的手術切除標本［包括胃癌組織和癌旁胃組織(距離正常胃癌組織5 cm)］。患者在術前均未接受任何放化療。男21例、女9例，年齡40～82歲、平均56歲。所取腫瘤組織均經術后病理診斷為胃癌，所取癌旁胃組織均經病理診斷未檢測到癌細胞。

1.2 方法

1.2.1 PCR法檢測胃癌組織和癌旁胃組織中p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ 的表達情況 應用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取胃癌組織和癌旁胃組織的總RNA。胃組織RNA逆轉錄反應:按照MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書及相關文獻操作，以試劑盒內的Oligo-p(dT)18Primer為隨機引物，以M-MuLV RT酶為逆轉錄酶進行體外逆轉錄反應。胃組織中 p53β、p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ 五種 p53 異構體PCR擴增。總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒、引物購自Sangon上海生工，BIO-RAD MyCyder PCR儀購自美國伯樂公司。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，將凝膠放入購自美國UVP的BioSpectrum AC凝膠成像系統掃描并拍照，并對電泳結果進行判定。

1.2.2 免疫組化PV-9000兩步法檢測胃癌、癌旁組織中MDM2和PTEN的表達情況 標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，常規HE染色，病理確診，免疫組化步驟按說明書進行。鼠抗人MDM2和PTEN單克隆抗體均購自北京中杉金橋，均為3 mL工作液。以PBS代替一抗作陰性對照。每張切片隨機選擇5個視野，共計數100個腫瘤細胞，分別計算2種抗體的陽性細胞百分率。由2位以上病理醫生對免疫組織化學染色進行評價，依據鏡下切片中陽性染色細胞占瘤細胞總數的比例分為2級，－:無染色或染色陽性細胞數≤10%，+:染色陽性細胞數＞10%。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件，數據以百分比表示，比較行χ2檢驗，應用Spearman’s等級相關進行相關性分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p53異構體在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達 在30例胃癌組織和癌旁胃組織中均未檢測到p53γ、Δ133p53β、Δ133p53γ 這三種異構體的 mRNA表達。Δ133p53的表達結果:在30例胃癌組織中有21例表達，占70.0%(21/30);在30例癌旁胃組織中有7例表達，占 23.3%(7/30);胃癌組織中Δ133p53表達高于癌旁胃組織(P ＜0.01)。p53β的表達結果:在30例胃癌組織中有8例表達，占26.7%(8/30);在30例癌旁胃組織中有21例表達，占70.0%(21/30)，胃癌組織p53β的表達低于癌旁胃組織(P ＜0.01)。

2.2 MDM2、PTEN在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達 MDM2的表達結果:在30例胃癌組織中有19例表達，占63.3%(19/30);在30例癌旁胃組織中有7例表達，占23.3%(7/30)，MDM2在胃癌組織中表達高于癌旁胃組織(P＜0.01)。PTEN的表達結果:在30例胃癌組織中有16例表達，占53.3%(16/30);在30例癌旁胃組織中有26例表達，占86.7%(26/30)，胃癌組織PTEN的表達低于癌旁胃組織(P ＜0.01)。

2.3 p53異構體和MDM2、PTEN表達的相關性分析 Spearman’s相關性分析顯示，Δ133p53和MDM2，p53β和PTEN在胃癌中表達呈正相關關系(r=0.408，P=0.025;r=0.413，P=0.023);Δ133p53和PTEN，p53β和MDM2在胃癌中表達呈負相關關系(r= －0.467，P=0.009;r= －0.480，P=0.007)。見表 1、2。

表1 胃癌組織中Δ133p53與MDM2、PTEN相關性分析

表2 胃癌組織中p53β與MDM2、PTEN相關性分析

3 討論

抑癌基因p53的功能失活在胃癌的發生發展過程中起重要作用，p53異構體的發現為胃癌發生機制的研究提供了新方向。p53異構體的活性主要通過改變內部啟動子的活性、p53 mRNA的剪接及p53異構體的亞細胞定位來實現［2］。最近研究發現，人類p53異構體(Δ133p53和p53β)能夠組成一內源性的調節機制，并且能夠作用于p53介導的復制細胞的衰老。在人類正常成纖維細胞中，p53β的誘導生成和Δ133p53的減少與復制細胞的衰老有關，這種衰老與癌基因所致的衰老不同。在結腸腺癌中可以觀察到Δ133p53表達水平升高和p53β表達水平下降，這可能是在從腺瘤到癌的進展過程中，逃脫了衰老障礙的一種信號［3］，即天然存在的p53異構體為復制細胞的衰老進行生理學上的調節。隨著體內試驗證據表明，p53異構體特異性表達的建立和缺失能夠分別誘導和逃脫衰老狀態，如果打破這種衰老機制則可以誘導腫瘤的生成。本研究顯示，在胃癌組織中發現Δ133p53 mRNA水平增高，p53βmRNA水平降低，與文獻報道一致。

p53基因是人類發現最早的抑癌基因，MDM2高表達呈現癌基因的功能，其表達產物在細胞核內可以與野生型和突變型p53結合使其功能失活。p53和MDM2之間存在著自我反饋環，該反饋環使細胞內的MDM2/p53比率保持恒定［4］。通過研究p53-MDM2自我反饋環，發現MDM2與p53結合后可使p53泛素化，泛素化的p53被蛋白酶體降解而直接被清除［5，6］。正確的亞細胞定位對于p53的活性十分重要，p53被激活后進人核內，激活其靶基因的轉錄，之后回到胞質中被降解。最近發現，p53向核外轉運可能以MDM2依賴性的方式進行控制，因為MDM2中含有的NLS和NES保證了MDM2可以穿梭于胞核與胞質之間，核內MDM2將p53捕獲，通過MDM2上的NLS將兩種蛋白質運出細胞核。如果細胞將MDM2修飾或改變核輸出裝置使MDM2滯留在核，p53將不被降解。PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因，該基因的編碼產物能夠使被PI3K激活的細胞內第二信使PIP3去磷酸化，從而影響細胞內 PI3K/Akt信號轉導途徑［7，8］。MDM2 是一原癌基因，最近研究表明，PI3K/Akt信號轉導途徑可以激活細胞的磷酸化過程，從而導致MDM2癌蛋白由胞質進入胞核，而PTEN可以通過對該信號轉導途徑的影響，阻止MDM2癌蛋白由胞質進入胞核，從而加速該蛋白的降解［7，9］。由此PTEN 參與到p53-MDM2自我反饋環中，形成了PTEN-MDM2-p53網絡環路，影響著腫瘤的生成。

本研究結果顯示，在胃癌組織和癌旁胃組織中p53異構體的表達情況不同，能夠檢測到Δ133p53、p53β 表達，未檢測到 p53γ、Δ133p53β、Δ133p53γ 的表達。Δ133p53、MDM2在胃癌組織中的表達高于癌旁胃組織，p53β、PTEN在癌旁胃組織中的表達高于胃癌組織。相關性分析顯示，Δ133p53和MDM2，p53β和 PTEN在胃癌中的表達均呈正相關;Δ133p53和PTEN，p53β和MDM2在胃癌中的表達均呈負相關。由此推測，在胃癌的發生、發展過程中，Δ133p53、p53β通過調節 p53活性，并以 p53為中介，影響了PTEN-MDM2-p53網絡環路中PTEN、MDM2蛋白的表達，并提示 p53異構體中的Δ133p53可能是通過降低PTEN、p53的抑癌蛋白表達及提高MDM2促癌蛋白的表達而發揮促癌作用的;而p53β可能是通過提高PTEN、p53的抑癌蛋白表達及降低MDM2促癌蛋白的表達，調控PTENMDM2-p53網絡環路從而促進胃癌的發生。

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