清肺合劑HPLC 指紋圖譜研究Δ

曹瑩瑩，林能明，方 羅（浙江省腫瘤醫(yī)院，杭州 310022）

清肺合劑是我院依據(jù)經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)的醫(yī)院制劑，由白花蛇舌草、浙貝母、夏枯草等10味中藥組成，功效清熱化痰解毒、軟堅(jiān)散結(jié)消腫，具有抗腫瘤作用[1～3]，并可減輕放射性肺損傷，防治早期肺纖維化。目前，該藥用于治療肺癌及肺癌、放射性肺炎引起的咳嗽多痰、胸痛、咳血等癥，療效肯定[4，5]。由于歷史原因，清肺合劑尚無(wú)完整的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。中藥指紋圖譜是一種用綜合、宏觀、非線性的分析觀念和質(zhì)控模式來(lái)全面表征中藥組成特征及質(zhì)量的分析技術(shù)，已成為國(guó)際認(rèn)同、提倡并推薦的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)手段[6，7]，在中藥各研究領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛[8，9]。因此，筆者應(yīng)用二極管陣列（DAD）檢測(cè)器建立樣品的等吸收?qǐng)D，優(yōu)化并建立清肺合劑的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，以期全面、整體地反映制劑質(zhì)量，保證制劑工藝和質(zhì)量的穩(wěn)定性，確保患者用藥安全。

1 儀器與試藥

1100 HPLC儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外DAD檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理工作站（美國(guó)Agilent公司）；BS 224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Multifuge 3R+高速離心機(jī)（德國(guó)Thermo Scientific（Heraeus）公司）；SY2200超聲波清洗儀（上海超聲儀器設(shè)備有限公司，頻率：59 kHz，功率：90 W）。

綠原酸、咖啡酸、野黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為 110753-200413、110885-200102、110842-200504，均為供含量測(cè)定用）；對(duì)香豆酸、迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為A0143、A0004，純度均≥98%）；清肺合劑（浙江省腫瘤醫(yī)院制劑室，批準(zhǔn)文號(hào)：浙藥 制 Z20050031，批 號(hào) ：090602、090609、090630、090714、090728、090804、090825、090901、090915、091013、091020、091103、091117、091124、091201、091208）；乙腈、甲醇（色譜純，浙江臨海市浙東特種試劑廠）；水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

為保證制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性和指紋圖譜的有效性，清肺合劑所用藥材的產(chǎn)地相對(duì)固定，產(chǎn)地如下：浙貝母（浙江）、白茅根（浙江）、重樓（云南、四川）、半枝蓮（浙江、江蘇）、夏枯草（貴州）、防己（浙江）、仙鶴草（浙江）、白花蛇舌草（浙江）、龍葵（浙江）、天龍（浙江）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品貯備液的制備

精密稱取綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、迷迭香酸對(duì)照品分別為0.002 3、0.000 5、0.001 9、0.003 3 g，分別置于10 mL量瓶中；精密稱取野黃芩苷對(duì)照品0.010 2 g，置于100 mL量瓶中，分別用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.230、0.050、0.190、0.102、0.330 g·L-1的綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、野黃芩苷和迷迭香酸對(duì)照品貯備液。4℃冰箱貯藏，備用。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取清肺合劑2 mL，置于10 mL量瓶中，以水稀釋至刻度，精密稱重，超聲30 min，冷卻后補(bǔ)足失重，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Elit SinoChrom ODS-AP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0→60 min，A的體積百分比為95%→66%）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：50 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：50 μL。該色譜條件下樣品與對(duì)照品的指紋圖譜分別見圖1、圖2。

圖1 各批清肺合劑的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of each batch of Qingfei mixture

圖2 對(duì)照品的HPLC指紋圖譜6.綠原酸；7.咖啡酸；9.對(duì)香豆酸；10.野黃芩苷；14.迷迭香酸Fig 2 HPLC fingerprint of substance control6.chlorogenic acid；7.caffeic acid；9.p-coumaric acid；10.scutellarin；14.rosmarinic acid

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一份清肺合劑供試品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3.0%，表明本方法精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份清肺合劑供試品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批清肺合劑適量，共6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，各主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

取16批清肺合劑適量，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)得到指紋圖譜；并利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”軟件生成清肺合劑對(duì)照指紋圖譜（見圖2），其中共有色譜峰16個(gè)，其峰面積占總峰面積的80.9%以上。經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間和紫外吸收曲線對(duì)比確認(rèn)，6號(hào)峰為綠原酸，7號(hào)峰為咖啡酸，9號(hào)峰為對(duì)香豆酸，10號(hào)峰為野黃芩苷，14號(hào)峰為迷迭香酸。其中對(duì)香豆酸色譜峰保留時(shí)間（約為（24.567±0.049）min）和峰響應(yīng)值適中、分離度理想，確定為參照峰（S峰）。以9號(hào)色譜峰為參照，計(jì)算共有特征峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，可得各峰保留時(shí)間穩(wěn)定，RSD在0.050%～0.508%之間。16批清肺合劑HPLC指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間見表1。

2.6 相似度評(píng)價(jià)

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”軟件對(duì)所有樣品的指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并計(jì)算16批清肺合劑指紋圖譜間及其與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度。結(jié)果，除批號(hào)為090915的樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度略低于0.9（0.894）以外，其余相似度均在0.936以上，表明各批樣品間的差異性較小。

表1 16批清肺合劑HPLC指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積與相對(duì)保留時(shí)間Tab 1 Relative peak area and relative retention time of the common peaks of HPLC fingerprints of 16 batches of Qingfei mixture

3 討論

為了得到滿意的分離效果，筆者比較了不同填料色譜柱（SinoChrom ODS-AP、SinoChrom ODS-BP、Lichrospher C18、Zorbax Elipse XDB-C18）的試驗(yàn)效果，結(jié)果以SinoChrom ODS-AP柱的分離效果最佳。由于合劑中的成分眾多，各化合物紫外吸收行為差異較大，故筆者同時(shí)采用DAD檢測(cè)器建立樣品的光譜-色譜3D吸收?qǐng)D和等吸收?qǐng)D，直觀、便捷、快速、準(zhǔn)確地選擇適宜的檢測(cè)波長(zhǎng)，考察190～400 nm區(qū)間不同波長(zhǎng)下的圖譜，結(jié)果在330 nm波長(zhǎng)下，色譜基線平穩(wěn)，噪聲干擾較小，各洗脫區(qū)段出峰均勻，色譜峰吸收豐度適中，圖譜信息完整。流動(dòng)相的pH值和溫度對(duì)分離效果的影響較大，故筆者分別以甲醇/乙腈和乙酸-乙酸銨緩沖系、磷酸-磷酸鹽緩沖系、三氟乙酸緩沖液的不同配比、不同濃度的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫試驗(yàn)，比較不同洗脫條件下的色譜圖，選擇分離效果好、峰數(shù)多、峰形佳、時(shí)間盡可能短的最佳色譜條件，最終確定以0.01%磷酸溶液和乙腈進(jìn)行梯度洗脫，能有效改善峰形，提高分離度，使基線漂移小。此外，選擇較高的柱溫也有利于分離。

通過(guò)相似度計(jì)算發(fā)現(xiàn)，16批樣品的相似度較高，均具有相同的色譜特征峰，分離分析效率高，且各色譜特征峰保留時(shí)間穩(wěn)定；相似度計(jì)算結(jié)果提示，清肺合劑的批間穩(wěn)定性較高，各批制劑的質(zhì)量具有一致性，表明本試驗(yàn)所建立的指紋圖譜具有穩(wěn)定性和可控性。

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