鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1重組蛋白的免疫保護效果試驗

路 嬌，羅 薇，劉內生，劉 群

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

鴨病毒性肝炎是由鴨甲肝病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）引起雛鴨的一種以肝臟呈現出血性炎癥為特征的急性、高度接觸性和致死性傳染病。該病呈世界性分布，我國以Ⅰ型鴨病毒性肝炎為主，嚴重危害了養鴨業的發展。目前我國普遍采用接種鴨肝炎弱毒活疫苗或注射高免卵黃抗體的方式預防該病，雖有效果，但存在病毒株變異、弱毒株返強、免疫安全等問題。因此，開拓疫苗研究的新領域是當前的熱點問題。Ⅰ型鴨甲肝病毒（DHAV-1）是小RNA病毒中的一員，其結構蛋白Vp1位于病毒殼體的表面，具有主要的型特異性抗原中和位點，已被證明具有良好的反應原性［1］，但其是否具有誘導機體產生中和抗體，使動物獲得保護的能力還不得而知。本試驗以表達純化的I型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1重組蛋白為抗原，制備Vp1重組蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨，采用間接ELISA方法對雛鴨的免疫保護效果進行檢測，通過動物攻毒試驗評價免疫保護效果。

1 材料

1.1 菌毒株 Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1基因原核表達工程菌（pET32a+Vp1，BL21（DE3）PlysS），由本實驗室構建并保存［1］；Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株，由西南民族大學動物醫學實驗室經雞胚傳代致弱［2］，TCID50=10-14.62／200 μL；攻毒毒株：西南民族大學動物醫學實驗室分離并鑒定的自臨床分離DHAV-1野毒，LD50=2-4／0.2mL。

1.2 試驗動物 購自四川省廣漢周邊地區DVH抗體陰性的1日齡非免疫雛鴨，本實驗室飼養至試驗適日齡。健康成年家兔，雄性，體重2～3kg，購自四川省實驗動物專委會養殖場。

1.3 血清 DHAV-1陽性血清（中和效價1∶320，批號：011012）、DHAV-1陰性血清，購自中國獸醫藥品監察所。

2 方法

2.1 Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1蛋白的原核表達、純化及濃度測定 將MY株Vp1基因原核表達工程菌按文獻［1］的方法進行大量誘導表達，收集菌體，PBS緩沖液懸浮，超聲波裂解，離心后收集沉淀和上清，沉淀用適量的PBS重懸。用含1%Triton-100、2mol／L尿素的 PBS反復洗滌，離心收集沉淀，再用含8mol／L尿素的PBS溶解沉淀，離心收集上清，然后進行透析、濃縮，SDS-PAGE電泳觀察。BCA蛋白定量試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。

2.2 兔抗MY株Vp1重組蛋白的多克隆抗體對細胞的中和保護力評價

2.2.1 抗MY株Vp1重組蛋白免疫血清的制備按照文獻［3］方法將高純度的MY株Vp1融合蛋白液（2mg／mL）作為抗原，與油佐劑按1∶1的比例配制成Vp1重組蛋白亞單位油乳劑疫苗，無菌檢驗后免疫家兔。將制得的MY株Vp1重組蛋白亞單位疫苗背部皮下6點注射，每只家兔接種1mL（蛋白終濃度為1mg／mL）。免疫3次，每次免疫間隔10d，三免后7d耳緣靜脈采血1mL，分離血清，瓊脂擴散試驗檢測血清免疫效價，采用瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價。待瓊脂免疫擴散法試血的血清效價≥1∶32時心臟采血，取血清分裝，-20℃保存備用。

2.2.2 細胞中和試驗（固定病毒-稀釋血清法） 取少量兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清56℃滅活30min，按 2-1、2-2……2-6進行稀釋。再將100TCID50／0.1mL的MY株雞胚化弱毒稀釋液與倍比稀釋的血清1∶1混合，37℃感作1h，向已培養好的雞胚成纖維細胞培養板加入不同稀釋度的0.2 mL病毒-血清混合液，同時做細胞對照、標準陽性血清+抗原對照和被檢血清毒性對照，置于溫箱吸附2h，繼續培養觀察，記錄細胞病變情況，6d后終判。

2.3 MY株Vp1重組蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨后抗體水平監測及攻毒保護試驗

2.3.1 動物分組與免疫 將ELISA檢測結果為陰性的3日齡非免疫雛鴨200只隨機分成A、B、C、D、E 5組，每組40只，右腿腿肌注射接種。免疫組A、B、C接種MY株Vp1蛋白亞單位疫苗，接種蛋白含量分別為50μg／只、100μg／只、200μg／只；免疫組D接種DHAV-1雞胚化弱毒MY株，免疫量為～ELD50／只；組E注射生理鹽水作為陰性對照組，0.2mL／只。

2.3.2 免疫雛鴨后抗體水平監測及攻毒保護試驗免疫后第3、5、7、9、14、21天分別從每組隨機抽取3只雛鴨采血，用純化重組Vp1蛋白作為包被抗原，間接ELISA法檢測血清中的Vp1蛋白抗體效價，監測免疫后各組雛鴨產生抗體的消長情況；同時，在各采血時間點隨機抽取5只雛鴨，用4LD50的臨床分離DHAV-1毒進行攻毒，觀察記錄每組鴨的死亡及存活情況，攻毒后第7天進行終判，統計各組的保護率。

3 結果與分析

3.1 Ⅰ型鴨甲肝病毒雞胚化弱毒MY株Vp1蛋白的原核表達、純化及濃度的測定 SDS-PAGE電泳結果顯示，得到了大小為47kDa的Vp1重組蛋白，依次用含1%Triton-100、2mol／L尿素的PBS洗滌包涵體得到了高純度的重組Vp1蛋白（圖1）。BCA蛋白定量法測得純化蛋白終濃度為983μg／mL。

圖1 Vp1重組蛋白的表達及純度的測定

3.2 兔抗MY株Vp1重組蛋白的多克隆抗體對細胞的中和保護力試驗 瓊擴試驗檢測制備兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清效價≥64，將免疫血清與MY株雞胚化弱毒在雞胚成纖維細胞上進行細胞中和試驗，Reed-Muench法計算結果。TCID50=10-1.65=1／45，即1／45為該兔抗 MY株 Vp1重組蛋白高免血清的中和抗體效價。同時，測得標準陽性血清的中和效價為1／53。結果表明，制備的兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清能夠對被MY株雞胚化弱毒感染的細胞產生保護，具有中和抗體的作用（圖2，3，4）。

圖4 7d血清中和對照

3.3 MY株Vp1重組蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨后抗體消長及免疫攻毒試驗

3.3.1 間接ELISA方法檢測不同劑量Vp1重組蛋白免疫后雛鴨血清的抗體效價 ELISA檢測結果表明，各組免疫雛鴨在免疫后的第3天均已產生抗體，在免疫后21d內，皆呈上升趨勢；各免疫組與陰性對照組比較差異極顯著（P＜0.01），各免疫組之間抗體水平差異不明顯（P＞0.05），見圖5。

3.3.2 免疫攻毒試驗 用4×LD50的臨床分離DHAV-1病毒進行攻毒，免疫組A、B、C（每組n=30只）雛鴨的存活率分別為47%、50%，57%，均高于組E（未免疫組）的20%，免疫組與未免疫組之間差異顯著（P＜0.05），組 A、B、C之間差異不明顯（P＞0.05）。但重組 Vp1各免疫組均低于組 D（MY株弱毒免疫組）的存活率83%。

4 討論

目前對DHAV的免疫預防主要依靠弱毒疫苗和滅活疫苗。但近年的流行病學調查發現，我國華南地區DHAV有不同的基因型和血清型病毒株的出現，而DHAV不同血清型之間不能產生交叉保護，因此，使弱毒疫苗免疫保護力有所下降，也是疫苗不能產生交叉保護的主要原因［4］。由于傳統疫苗存在的固有缺陷，如潛在的毒力返強威脅和免疫鴨疫苗株與野毒株難以區別等，為DHAV的控制帶來了困難，因此研制安全有效的DHAV疫苗是亟待解決的問題，確定病毒中與免疫相關的位點則非常重要。

本試驗將DHAV-1MY株Vp1重組蛋白為抗原制成的亞單位疫苗免疫家兔，將制備的兔抗MY株Vp1重組蛋白高免血清與MY株雞胚化弱毒進行細胞中和試驗，結果表明，制備的兔抗 MY株Vp1重組蛋白高免血清和標準陽性血清一樣能夠對被MY株雞胚化弱毒感染的細胞產生保護，具有中和抗體的作用。同時，動物攻毒試驗結果表明，重組Vp1免疫雛鴨的存活率均高于未免疫組（P＜0.05），但低于組 MY株弱毒免疫組，且差異顯著（P＜0.05）。結果表明，重組Vp1蛋白免疫后使雛鴨獲得了一定的免疫保護。這與裴宗飛［3］報道的Vp1-C3d-pcDNA3基因疫苗免疫效果的研究結論相符，單一蛋白抗原誘導機體產生抗體的保護力偏低。但也有學者認為Vp1重組蛋白以沒有活性的包涵體形式表達，在復性過程中形成了一些無活性的多聚體，不具有蛋白的天然構象，從而丟失了一些抗原表位［5］，使最終的免疫效果受到影響；何冉婭等［4］發現其在2007～2009年華南地區分離的DHAV毒株的RGD或QSD基序存在變異，變異會改變病毒粒子與細胞受體之間的關系，引起免疫效果降低；近來也有試驗證明，DHAV-1結構蛋白VP3同樣具有免疫原性［6］，提示DHAV-1亞單位疫苗的研制要趨向于多個抗原組合的應用，才能獲得更高的免疫保護［7-8］；這些還尚需要進一步的試驗確認。

［1］向毅勇，羅薇，靳艷玲，等.鴨肝炎病毒雞胚化弱毒 MY株Vp1基因克隆、原核表達及抗原性分析［J］.中國畜牧獸醫，2010，37（12）：68-73.

［2］羅薇，張金靈，劉內生，等.Ⅰ型鴨肝炎病毒雞胚致弱毒 MY株的培育及實驗研究［J］.內蒙古農業大學學報，2010，31（1）：9-14.

［3］裴宗飛.鴨病毒性肝炎C3d新型分子佐劑基因疫苗的研究［D］.山東：山東農業大學，2009.

［4］何冉婭，于淼，張玉玲，等.2007～2009年華南地區鴨肝炎病毒流行病學調查及分離株的Vp1基因變異分析［J］.中國動物傳染病學報，2010，18（1）：7-15.

［5］劉利芳.乳膠凝集試驗、間接ELISA診斷鴨病毒性肝炎方法的建立［D］.福州：福建農林大學，2009.

［6］劉家森，甘一迪，姜騫，等.鴨肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表達［J］.中國獸醫學報，2008，38（7）：587-590.

［7］Bosch H V D，Frey J.Interference of outer membrane protein PalA with protective immunity against Actinobacillu spleurop neumoniae infections in vaccinated pigs［J］.Vaccine，2003，21：3601-3607.

［8］曹素芳，黃青云.禽多殺性巴氏桿菌C48-1成熟外膜蛋白H重組亞單位疫苗免疫效果的研究［J］.中國獸醫科學，2006，36（6）：464-467.