內(nèi)皮型氧化亞氮合酶基因G894T、胰島素受體基因第17外顯子多態(tài)性與老年癡呆的關(guān)系研究

周偉宏,吳永華

(江蘇省蘇州市立醫(yī)院老年科,江蘇蘇州,215002)

近年來,隨著世界人口老齡化速度的加快,老年癡呆患者逐年增加,給家庭及社會造成了沉重的負擔。老年癡呆研究逐漸成為熱點[1]。阿爾茨海默病(AD)與血管性癡呆(VaD)是老年人癡呆的兩大主要病因。同時近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)[2-3]內(nèi)皮型氧化亞氮合酶基因G894T多態(tài)性、胰島素受體基因第17外顯子(1058位點)多態(tài)性與動脈硬化、高血壓、冠心病、腦卒中等有關(guān)。但很少有將AD和VaD放在一起進行相關(guān)性的研究報道[4]。本研究選取阿爾茨海默病與血管性癡呆患者各50例,探討內(nèi)皮型氧化亞氮合酶基因第7外顯子G894T多態(tài)性、胰島素受體基因第17外顯子多態(tài)性與老年癡呆的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年3月～2012年4月本院門診及住院的AD患者50例作為AD組。經(jīng)簡易精神狀態(tài)檢查表(MMSE評分)和美國精神醫(yī)學協(xié)會《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》第4版(DSM-Ⅳ)診斷為癡呆,缺血指數(shù)量表(Hachinski)評分<4分,均符合美國神經(jīng)病學、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關(guān)疾病協(xié)會(NINCDS-ADRAD)AD診斷標準。另選VaD患者50例為VAD組,經(jīng)MMSE評分和DSM-Ⅳ診斷為癡呆,Hachinski評分>7分,符合美國國立神經(jīng)病學與中風研究所-神經(jīng)科學國際研究協(xié)會(NINDS-AIREN)VaD診斷標準。對照組為同期收集的健康老年人50例。無糖尿病、高血壓、心臟疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病,MMSE評分正常。受試者在年齡、性別、空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、收縮壓、舒張壓比較均匹配(P>0.05)。見表1。

表1 3組患者一般臨床資料比較( x±s)

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA的提取:于肘靜脈處抽取受試者清晨空腹靜脈血5 mL,-20℃保存,采用全血基因組DNA提取試劑盒進行基因分析。

1.2.2 eNOS G894T基因型測定:應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法(PCRRFLP),擴增eNOS G894T基因片段的引物序列分別為:上游 5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTG GTACAC-3′、下游 5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′。反應(yīng)條件:94 ℃變性30 s,63℃退火30 s,72℃延伸1 min,40個循環(huán),取PCR擴增產(chǎn)物10 μ L和酶切體系10 μ L,10×緩沖液10 μ L,去離子水3 μ L,入重蒸水使總體積為50 μ L,37℃酶切16 h,用限制性內(nèi)切酶PmⅡ進行消化,取酶切產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

1.2.3 INSR基因第17外顯子(1058位點)基因型測定:應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法(PCR-RFLP),第17外顯子PCR擴增引物,上游為:5′-CCAAGGATGCTGTGTAGA TAAG-3′,下游為:5′-TCAGGAAAGCCAGC C-3′。PCR完畢后,用限制性內(nèi)切酶PmlI進行消化,取酶切產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 GG、GT和TT基因型分布頻率

AD組、VaD組與對照組的GG、GT和TT基因型分布頻率分別比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 受試者的G894T基因型分布(%)

2.2 INSR T等位基因頻率

AD組患者的INSR T等位基因頻率高于對照組,但差異不明顯(P>0.05)。VAD組患者的INSR T等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05),GG、GT和 TT基因型分布頻率和 INSR T等位基因頻率在AD組和VaD組無顯著差異。各基因型分布符合 Harding Weinberg定律。見表3。

表3 受試者的INSR基因第17外顯子各等位基因分布[n(%)]

3 討 論

近年來,隨著對AD發(fā)病機制研究的不斷深入,逐漸發(fā)現(xiàn)血管源性因素在AD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。許多證據(jù)表明[5]腦血管病和AD存在多種相同的血管因素。本實驗從基因?qū)用娼沂続D和VaD的共性,為進一步證明AD和VaD可能并非兩個獨立疾患提供新的證據(jù),也為將來可能的基因治療提供新的途徑。到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十多種eNOS的基因多態(tài)性位點[6],其中內(nèi)皮型氧化亞氮合酶基因G894T突變與原發(fā)性高血壓、冠心病存在相關(guān)關(guān)系[7]。本研究通過應(yīng)用PCR-RFLP,發(fā)現(xiàn)AD組患者和VaD組的GG、GT和 TT基因型分布頻率與對照組患者相應(yīng)的基因型分布頻率比較,差異都有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明內(nèi)皮型氧化亞氮合酶基因G894T的多態(tài)性與AD和VaD的發(fā)生、發(fā)展可能存在相關(guān)性。該研究結(jié)果可能對阿爾茨海默病以及血管性癡呆的基礎(chǔ)研究和臨床防治有一定指導意義。Watanabe等[8]的研究提示動脈粥樣硬化可能為AD和VaD的獨立危險因素,可能由于不同地區(qū)人種的差異導致。

近年來胰島素受體基因第17外顯子多態(tài)性被證實與動脈粥樣硬化、高血壓病、糖尿病的獨立危險因素[9]。胰島素/胰島素受體信號級聯(lián)系統(tǒng)正常運行也是維持大腦血液運行和能量代謝正常進行的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)AD組患者和VAD組患者的INSR T等位基因頻率高于對照組,可能是由于胰島素受體mRNA定位于神經(jīng)元的胞體上,在海馬和額葉前皮層齒狀回和海馬CA1和CA3區(qū)有大量的胰島素受體分布。海馬CAI和齒狀回的胰島素受體mRNA上調(diào)和胰島素受體增多可以改善學習過程,胰島素及胰島素信號系統(tǒng)可能直接參與認知功能[10-12]。可以推測胰島素受體缺陷導致大腦神經(jīng)細胞胰島素信號傳導障礙可以引起認知功能障礙,這與孫紅[9]相關(guān)性結(jié)果一致。本研究GG、GT和 TT基因型分布頻率和INSR T等位基因頻率在AD組和VaD組無顯著差異。可能提示AD和VaD在基因?qū)用娲嬖谥残?也可能由于樣本量較少未統(tǒng)計出差異,有待于進一步研究證實。

綜上所述,由于目前對于AD和VaD的早期診斷、早期干預(yù)成為熱點,但至今無針對AD和VaD有效的治療方法。要找到有效的方法,就需要大量更深入的研究,更詳盡揭示AD和VaD的本質(zhì)及發(fā)病機制,本研究證實AD和VaD存在相同的基因危險因素[13-14],為更深入的揭示AD和VaD的發(fā)病機制及2者間共性提供新的證據(jù)。

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