豬圓環病毒2型CC株ORF3基因序列分析及真核表達

黃文明，徐廷川，張亮權，張得玉，張民澤，張桂紅

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642）

豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是一種無囊膜的單股負鏈環狀DNA病毒。PCV2是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndromme，PMWS）的主要病原，成為危害養豬生產的重要病原之一。

Hamel等［1］應用軟件對PCV基因組進行了分析，發現PCV基因組含有11個潛在的開放閱讀框（ORF），ORF1、ORF2為主要閱讀框，ORF1編碼與病毒復制相關的蛋白（Rep），ORF2編碼病毒的主要結構蛋白（Cap）。近年來，針對PCV2基因功能的研究主要集中在ORF1和ORF2基因［2］。ORF3基因為近兩年來新鑒定的一個具有重要功能的基因，其編碼的蛋白對病毒在細胞培養物中的復制是非必須，但介導PCV2誘導的細胞凋亡［3］。

本試驗從疑似PMWS的死亡仔豬組織病料中擴增得到了ORF3基因并對其進行了序列分析，成功的表達重組pEGFP-N2-ORF3蛋白，為進一步研究PCV2在華南地區的分子流行病學、遺傳變異及防治奠定了基礎。

1 材料

1.1 病料 廣東省佛山市某豬場送檢病料（斷奶仔豬的脾、淋巴結、肺等），-70℃ 保存備用。

1.2 質粒、菌株和試劑 大腸桿菌JM109、BL21由華南農業大學獸醫學院傳染病研究室保存；pEGFP-N2真核表達載體購自CLONTECH公司；DNA提取試劑盒、限制性內切酶Eco R I和Xho I、DNA Marker DL-2000均為寶生物工程（大連）有限公司產品；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit為OMEGA公司產品；其他常規試劑均為國產分析純試劑。

1.3 引物 根據GenBank中PCV2的核酸序列，設計一對擴增ORF3的引物，并在上、下游引物分別加入Eco RⅠ和SalⅠ的酶切位點。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

上 游 引 物 A：5′-CTCGAGATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′

下游引物 B：5′-GAATTCTTACTGATAGAATGTGGAGC-3′

1.4 模板的制備 取少量死亡豬組織病料充分研磨制成懸浮液，反復凍融3次，10000r／min離心取上清，用DNA抽提試劑盒提取DNA，取適量用作PCR模板。

1.5 ORF3片段的PCR擴增 采用20μL體系：滅菌雙蒸水13.5μL；10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）2μL；2.5mmol／L each dNTP Mixture 2μL；上、下游引物各0.5μL；TaKaRa TaqTMDNA 聚合酶0.25μL；DNA 2μL。擴增條件：95℃5min預變性；然后95℃1min，53℃30s，72℃40s，30個循環，72℃6min。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.6 PCR產物的克隆 回收上述PCR產物，用Eco RⅠ和SalⅠ對獲得的PCR回收產物進行雙酶切，酶切后連接到pMD18-T載體上；轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，提取重組克隆質粒，經PCR和酶切鑒定，篩選陽性克隆測序并進行序列分析。

1.7 重組表達載體的構建 雙酶切重組克隆質粒后將獲得的ORF3片段與雙酶切后的pEGFP-N2載體連接、轉化；通過酶切和PCR篩選、測序鑒定含目的片段的重組子，并命名為pEGFP-N2-ORF3。

1.8 轉染用質粒的提取 使用OMEGA無內毒素大提質粒試劑盒提取，按說明書操作。

1.9 細胞轉染 將正常培養的PK15細胞用胰酶消化，800r／min離心5min，去上清，細胞用無抗生素無血清的RPMI 1640培養液重懸。將細胞以2×105／孔接種于預置玻片的24孔板中，37℃培養。待細胞生長到占玻片約70%～80%時，進行轉染。轉染過程根據Invitrogen轉染試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 ORF3目的片段擴增 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，可見一條約315bp的條帶，該條帶的大小與目的片段ORF3的預期大小相符（圖1）。

圖1 ORF3基因的PCR擴增產物

2.2 同源性比較及序列分析 測序得知，克隆于重組質粒中的ORF3基因長315bp，與預期相符，它編碼105個氨基酸（圖3），該基因在GenBank中的登錄號為BAA88133。將該基因與GenBank中的PCV2 毒 株 （AF055392、AF055394、EU148503、AY181946、EF524532、AF364094，毒株均為 PCV2分型標準株）的ORF3基因核苷酸及推導氨基酸序列進行了同源性比較。結果顯示，PCV2 CC株ORF3的核苷酸序列與參考毒株的相似性為96.2%～99.0%，推導的氨基酸序列同源性為90.5%～98.1%（表1）。同時還可以看出，PCV2 ORF3C-端都含有大量的親水性氨基酸（Ser）且較為保守（圖3）。

圖2 PCV2CC株ORF3基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列

表1 PCV2CC株ORF3與參考株ORF3基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比較 （%）

圖3 PCV2ORF3基因推導的氨基酸序列比較

2.3 ORF3真核表達載體的構建及鑒定 重組的pEGFP-N2-ORF3經Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切，和PCR鑒定，結果表明，Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切可以切出和315bp的DNA片段。用引物A和B作擴增，可獲得約315bp的目的片段（圖4）。

2.4 細胞轉染 將pEGFP-N2-ORF3融合表達載體和pEGFP-N2載體分別轉染COS-7細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白表達情況。pEGFP-N2轉染細胞于培養后5～6h在細胞內可見分布均勻的亮綠色熒光（圖5-a），且隨培養時間的延長細胞不出現死亡；而轉染pEGFP-N2-ORF3的細胞均于轉染后7～8h出現熒光（圖5-b），繼續培養至38h熒光細胞的數量明顯減少，熒光細胞大量死亡后飄浮在細胞生長液中。與對照組相比，試驗組許多細胞收縮，細胞內出現空泡，細胞膜發泡，細胞的染色質濃縮，并靠近核膜，有核著邊現象，核膜裂解、染色質分割成塊狀，晚期形成凋亡小體，并從皿底脫落、死亡。

圖4 重組質粒pEGFP-ORF3的酶切鑒定

圖5 pEGFP-N2-ORF3在COS-7細胞中的表達 （10×）

3 討論

本試驗選用疑似PMWS的死亡仔豬組織病料，應用PCR技術成功的擴增了ORF3基因，通過克隆與測序，發現與其他PCV2毒株的ORF3核苷酸序列相似性為96.2%～99.0%，推導的氨基酸序列同源性為90.5%～98.1%，其中與AF055392-ORF3a和AF055394-ORF3b的核苷酸序列同源性為99.0%，氨基酸序列同源性為98.1%，同源性相對較高，說明CC株可能屬于其中一個亞型；而與AF364094-ORF3f的核苷酸序列同源性為97.8%，氨基酸序列同源性為94.3%，同源性相對較低，可能與這些毒株的分離地點不同有關，也就是說PCV毒株存在地區差異性［4］。從總體情況來看，PCV2的ORF3基因變異相對較大，有些毒株之間的ORF3核苷酸及推導的氨基酸序列同源性僅為96.2%和90.5%，變異散布于整個ORF3，這些差異可能與ORF3介導的細胞凋亡速度有關，須進一步試驗研究。

近年來，已經有不少學者關于Rep蛋白感染細胞定位的研究，Gilpin等［5］用PCV2感染PK15細胞后，發現Rep蛋白主要位于細胞核，但是很少對ORF3編碼蛋白產物進行細胞感染定位。本試驗成功構建了重組質粒pEGFP-N2-ORF3，將pEGFP-N2-ORF3轉染COS-7細胞，在細胞核和細胞漿內可見分布均勻的亮綠色熒光，尤其在細胞核中表達量較高，而在38 h后部分細胞死亡后漂浮于細胞液上，表明融合表達的ORF3編碼產物對細胞有毒性作用，能夠加速細胞死亡，與李增魁的報道一致［6］。ORF3重組蛋白的成功表達為研究ORF3編碼蛋白的生物學活性及病毒感染的致病的分子機理、病毒遺傳變異特征等領域的深入和系統研究奠定了基礎。

［1］Hamel A L，Nayar G P.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs［J］.J Virol，1998，72：5262-5267.

［2］林彥星，孫彥偉，劉鎮明，等.豬圓環病毒II型ORF2截短基因的克隆及原核表達 ［J］.中國獸醫學報，2007，27（4）：464-468.

［3］Liu J，Chen I，Kwang J.Characterization of a previously unidentified viral protein in Porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis［J］.J Virol，2005，79（13）：8262-8274.

［4］盧銀華，陳德勝，華修國，等.豬圓環病毒2型ORF2基因序列分析及真核表達載體的構建 ［J］.中國病毒學，2002，17（1）：87-91.

［5］Gilpin D F，Mc Cullough K，Meehan B M，et al.In vitro studies on the infection and replication of porcine circovirus type 2 in cells of the porcine immune system ［J］.Vet Immunol Immunopathol，2003，94（3-4）：149-161.

［6］李增魁.豬圓環病毒2型ORF3編碼蛋白的體外表達［J］.畜牧與獸醫，2008，40（9）：25-30.