復(fù)方特比萘芬納米乳的皮膚安全性及經(jīng)皮滲透性試驗(yàn)

劉梅雪，歐陽五慶，吳敬超，宋 冰，芮 弦

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100）

特比萘芬是廣譜抗真菌新一代丙烯胺類藥物，其作用機(jī)制是通過高選擇性抑制真菌細(xì)胞膜內(nèi)麥角甾醇合成過程中的角鯊烯環(huán)氧化酶使鯊烯積聚而產(chǎn)生殺菌作用，其抗菌譜廣，抗菌作用強(qiáng)，作用持久且毒性低［1］。納米乳是由油相、水相、表面活性劑及助表面活性劑以適當(dāng)比例混合形成的一種透明或半透明、低黏度的動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定體系，其粒徑一般介于1～100nm之間［2］。納米乳作為極具潛力的新型藥物載體，具有其他藥物載體不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如增強(qiáng)藥效、提高藥物生物利用度、緩釋靶向和透皮性好等優(yōu)點(diǎn)［3］。近年來，透皮吸收制劑的應(yīng)用開發(fā)越來越多，而納米乳因其特有的理化性質(zhì)，在透皮吸收制劑的研究方面受到了極大的關(guān)注。

在皮膚真菌病中，由于真菌菌絲可侵入角質(zhì)層深部，因此，抗真菌藥物中表皮給藥劑型的療效與其經(jīng)皮滲透能力有關(guān)。本試驗(yàn)以小鼠皮膚為模型，應(yīng)用改良的Franz立式擴(kuò)散池，對受試動物復(fù)方特比萘芬納米乳進(jìn)行了體外經(jīng)皮透過性評價，考察了其主藥特比萘芬的經(jīng)皮滲透性［4］，并通過皮膚刺激性試驗(yàn)、皮膚急性毒性試驗(yàn)和皮膚過敏試驗(yàn)對復(fù)方特比萘芬納米乳進(jìn)行安全性評價，以期為獸醫(yī)臨床安全給藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要藥品與試劑 特比萘芬，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；肉豆蔻酸異丙酯，購自浙江物美化學(xué)品有限公司；吐溫－80，購自天津市恒星化學(xué)試劑制造有限公司；甲醇、乙腈為色譜純試劑，其他試劑如醋酸銨、磷酸二氫銨等均為國產(chǎn)分析純。

1．2 試驗(yàn)動物 健康家兔70只，體重約在2．0～2．5kg之間；白色豚鼠30只，體重約在250～300g之間；昆明系小鼠6只，體重在20～22g之間，均購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1．3 主要儀器 UV－2450紫外－可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；Hitachi高效液相色譜儀配紫外檢測器（日本 Hitachi公司）；HC－188透皮擴(kuò)散儀（天津市正通科技有限公司）；Diamonsil C18柱、電子天平及AS－3120超聲儀等。

1．4 復(fù)方特比萘芬納米乳及空白納米乳的制備

1．4．1 復(fù)方特比萘芬納米乳的制備 室溫下，按配方量將特比萘芬及其復(fù)方成分溶于肉豆蔻酸異丙酯（IPM）中，然后加入無水乙醇使其全部溶解，再加入吐溫－80攪拌均勻，最后邊攪拌邊滴加配方量的蒸餾水，即可制備出復(fù)方特比萘芬納米乳。

1．4．2 空白納米乳的制備 室溫下，按配方量將肉豆蔻酸異丙酯加入無水乙醇中使其全部溶解，再加入吐溫－80攪拌均勻，最后邊攪拌邊滴加配方量的蒸餾水，即可制備出空白納米乳。

1．5 皮膚刺激性試驗(yàn)

1．5．1 動物分組 選擇健康家兔36只（單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)和多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)各18只），隨機(jī)分為生理鹽水組、空白納米乳組和復(fù)方特比萘芬納米乳組，每組6只（完整皮膚和破損皮膚各3只）。

1．5．2 試驗(yàn)動物的處理 將上述已分好組別的家兔于給藥前24h，用剪毛剪除去脊柱兩側(cè)被毛，然后均勻涂抹脫毛劑，2min后，用干棉球沾溫水將脫毛劑和脫落的被毛一并洗干凈，去毛面積約150 cm2。去毛24h后檢查去毛部位皮膚是否有損傷，以無紅斑、水腫及破損為佳。破損皮膚組需建立損傷皮膚模型，方法是用無菌針頭在脫毛區(qū)皮膚上劃“井”字，以劃破表皮滲血為宜，并控制左右兩側(cè)皮膚的破損程度基本保持一致。

1．5．3 單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn) 采用左右側(cè)自身對比，左側(cè)脫毛區(qū)按0．5mL／只涂復(fù)方特比萘芬納米乳，右側(cè)不涂抹作對照，用雙層紗布覆蓋，膠布固定，每只家兔單籠飼養(yǎng)。給藥24h后，用溫水清洗涂抹部位，去除殘留藥物，觀察記錄去除藥物后1、24、48h和72h時涂抹部位有無紅斑和水腫反應(yīng)。涂抹部位依據(jù)皮膚刺激性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)評分，并計(jì)算其刺激分值。刺激分值＝（紅斑反應(yīng)總分＋水腫反應(yīng)總分）／每組動物數(shù)，生理鹽水組、空白納米乳組試驗(yàn)方法同復(fù)方特比萘芬納米乳組。

1．5．4 多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn) 采用左右側(cè)自身對比，左側(cè)脫毛區(qū)按0．5mL／只涂復(fù)方特比萘芬納米乳，右側(cè)不涂抹作對照，并用雙層紗布覆蓋，膠布固定。每只家兔單籠飼養(yǎng)，每天定時涂抹給藥1次，連續(xù)涂抹7d。在每次去除藥物后1h，觀察記錄涂抹部位有無紅斑和水腫反應(yīng)，并進(jìn)行評分，計(jì)算每天每只動物平均積分，判定皮膚刺激性強(qiáng)度。生理鹽水組、空白納米乳組試驗(yàn)方法同復(fù)方特比萘芬納米乳組。

1．6 皮膚急性毒性試驗(yàn)

1．6．1 動物分組 選擇健康家兔32只，隨機(jī)分為4組，分別為生理鹽水組，空白納米乳組、1%復(fù)方特比萘芬納米乳組、2%復(fù)方特比萘芬納米乳組，每組8只（完整皮膚和破損皮膚各4只）。

1．6．2 試驗(yàn)動物的處理 將上述已分好組別的家兔于給藥前24h脫毛，每組用4只家兔進(jìn)行完整皮膚刺激性試驗(yàn)，另4只建立損傷皮膚模型，方法同1．5．2項(xiàng)。

1．6．3 方法 對照組涂生理鹽水，其余3組分別在脫毛區(qū)及劃破皮膚區(qū)涂敷各自濃度的藥物（0．5 mL／只），用雙層紗布覆蓋，膠布固定，每只家兔單籠飼養(yǎng)。給藥24h后，用溫水清洗涂抹部位，去除殘留藥物，每日觀察，連續(xù)7d，觀察家兔皮膚、眼、黏膜及呼吸、活動等情況，并在給藥后第3天、第5天和第7天稱取家兔體重。

1．7 皮膚過敏性試驗(yàn)

1．7．1 動物分組 將豚鼠隨即分成3組，每組10只。第1組涂抹1%復(fù)方特比萘芬納米乳，第2組為空白納米乳，第3組為2，4－二硝基氯代苯。

1．7．2 試驗(yàn)動物的處理 試驗(yàn)前24h用脫毛膏在豚鼠頸背部脊柱兩側(cè)3cm范圍內(nèi)脫毛。

1．7．3 致敏接觸 取0．2mL 1%復(fù)方特比萘芬納米乳涂于濾紙上，將其貼敷在左側(cè)脫毛區(qū)，兩層紗布一層油紙覆蓋，再用無刺激的膠布密封固定6h。第7天和第14天在背部同一區(qū)域以同樣的方式操作。

1．7．4 激發(fā)接觸 末次致敏后14d，以相同的方法將復(fù)方特比萘芬納米乳貼敷在豚鼠右側(cè)脫毛區(qū)，6h后去除貼敷物，即刻觀察，并于24、48、72h再次觀察皮膚過敏反應(yīng)情況，皮膚過敏反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)［4］評定（空白納米乳與2，4－二硝基氯代苯試驗(yàn)方法同復(fù)方特比萘芬納米乳）。

1．8 特比萘芬分析方法的建立

1．8．1 色譜條件的選擇 色譜柱 Diamonsil C18 5μm 250×4．6mm；流動相：甲醇－0．05mol／L醋酸銨緩沖液溶液（80∶20）；檢測波長：282nm；流速為1．2mL／min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

1．8．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用流動相稀釋特比萘芬對照品溶液，精密配制濃度分別為10、15、20、25、30 μg／mL的特比萘芬對照品系列溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品藥物濃度（x）對色譜峰面積（y）進(jìn)行線性回歸。

1．8．3 回收率試驗(yàn) 精密量取特比萘芬對照品溶液適量，置10mL容量瓶中，加入空白納米乳定容至刻度，用流動相配制成濃度分別為20μg／mL、25 μg／mL、30μg／mL的待測溶液進(jìn)行測定，每個濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，將測定的峰面積值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出實(shí)測濃度，并計(jì)算其回收率、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1．9 透皮試驗(yàn)

1．9．1 離體鼠皮的制備 將小鼠處死，用脫毛劑脫毛，剝離腹部皮膚，小心刮去皮下脂肪和粘連物，用生理鹽水沖洗干凈，冷凍保存，待用。

1．9．2 透皮方法 將小鼠腹部皮膚固定在Franz擴(kuò)散池的2個半池之間，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為轉(zhuǎn)速為600r／min。接受液為pH值7．4的磷酸鹽緩沖液。取1mL復(fù)方特比萘芬納米乳適量均勻涂布予皮膚表明，分別于0．25、0．5、1、1．5、2、3、4、6、8、10、12h取樣1mL（同時補(bǔ)充等量同溫接收液），用0．45μm微孔濾膜過濾，用1．8項(xiàng)所建立的特比萘芬含量測定方法進(jìn)行測定。按下式計(jì)算單位面積透皮量（Qn），并計(jì)算穩(wěn)態(tài)透皮速率（J）［μg／（cm2）·h］［6］。對照組為藥物的飽和溶液組，試驗(yàn)方法同復(fù)方特比萘芬納米乳。

其中，Cn為第n個取樣點(diǎn)測得的藥物濃度（μg／mL）；V為接收液體積（5mL）；Ci為第i個取樣點(diǎn)測得的藥物濃度（μg／mL）；Vi為取樣體積（1mL）；A為滲透面積（0．758cm2）。以單位面積累計(jì)滲透量為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，所得直線的斜率為穩(wěn)態(tài)透皮速率J。

2 結(jié)果與分析

2．1 皮膚刺激試驗(yàn) 在對家兔單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)中，復(fù)方特比萘芬納米乳和空白納米乳對完整皮膚，均未引起紅斑和水腫刺激反應(yīng)，各觀察時間點(diǎn)的刺激分值均為0，屬無刺激性；復(fù)方特比萘芬納米乳和空白納米乳對破損皮膚，在觀察時間點(diǎn)1h時，刺激分值均為0．5，屬溫和的輕度刺激性，1h后的刺激分值均小于0．5，屬無刺激性。復(fù)方特比萘芬納米乳和空白納米乳對完整皮膚多次給藥，均未引起紅斑和水腫刺激反應(yīng)，每天每只動物的平均刺激分值均為0，屬無刺激性；復(fù)方特比萘芬納米乳和空白納米乳對破損皮膚多次給藥時，均未引起水腫刺激反應(yīng)，在前4d每天每只動物的平均刺激分值在0．50～0．65之間，屬輕度刺激性；5d后其平均刺激分值均小于0．5，屬無刺激性；試驗(yàn)結(jié)束時，計(jì)算得到的每天每只動物平均刺激分值均為0．3，屬無刺激性。

2．2 皮膚急性毒性試驗(yàn) 在皮膚急性毒性試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組中家兔均未出現(xiàn)異常反應(yīng)和死亡，其采食、體質(zhì)量、脫毛區(qū)皮膚、眼睛結(jié)膜、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動均未見明顯異常。初步認(rèn)為復(fù)方特比萘芬納米乳對家兔正常生長無明顯的影響，外用安全低毒。試驗(yàn)中家兔體質(zhì)量增長情況見表1。

表1 不同濃度復(fù)方特比萘芬納米乳皮膚急性中毒對家兔體重的影響 （±SD，n＝8）

表1 不同濃度復(fù)方特比萘芬納米乳皮膚急性中毒對家兔體重的影響 （±SD，n＝8）

組別 試驗(yàn)前體重（kg）試驗(yàn)后體重（kg）第3天 第5天 第7天1%復(fù)方特比萘芬納米乳2．12±0．12 2．21±0．10 2．28±0．12 2．34±0．11 2%復(fù)方特比萘芬納米乳 2．12±0．20 2．22±0．19 2．29±0．20 2．34±0．20空白納米乳組 2．05±0．21 2．16±0．22 2．20±0．21 2．26±0．22生理鹽水組2．14±0．19 2．24±0．20 2．29±0．19 2．36±0．20

2．3 皮膚過敏試驗(yàn) 在皮膚過敏試驗(yàn)中，2，4－二硝基氯代苯陽性對照組致敏發(fā)生率為100%，而復(fù)方特比萘芬納米乳和空白納米乳的皮膚過敏反應(yīng)評分值為零，屬弱致敏物。

2．4 復(fù)方特比萘芬納米乳中特比萘芬含量的測定方法 通過線性回歸求得特比萘芬的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝20 922x＋8 320．2，R2＝0．995 1（見圖1），特比萘芬在1～15μg／mL檢測濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，特比萘芬的平均回收率為（98．80±1．55）%，RSD為1．57%，表明測定方法的準(zhǔn)確度高。

2．5 透皮試驗(yàn) 經(jīng)回歸得到復(fù)方特比萘芬納米乳中特比萘芬的Qn方程為y＝0．840 3x＋0．191 6（r＝0．979），其透皮速率為0．840 3μg／cm·h。特比萘芬飽和溶液的Qn方程為y＝0．266 8x－0．155 5（r＝0．981），透皮速率為0．2668μg／cm·h。復(fù)方特比萘芬納米乳中特比萘芬與其飽和溶液相比，透皮速率增加將近4倍，說明納米乳促進(jìn)了特比萘芬的透皮吸收（圖2，3）。

圖1 特比萘芬的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 特比萘芬對照品及復(fù)方特比萘芬納米乳樣品色譜圖

圖3 累計(jì)滲透量－時間曲線

3 討論

藥物安全性評價是為評價藥物的安全性，在實(shí)驗(yàn)室條件下，用試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行的各種毒性試驗(yàn)。它是新藥研發(fā)的必需組成部分，其目的在于了解藥物單次或短時間多次給藥后，動物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，為臨床安全用藥及監(jiān)測提供一定的參考，并對判斷一種藥物能否進(jìn)入臨床研究，預(yù)測臨床研究的風(fēng)險(xiǎn)程度，為臨床研究提供重要的安全性依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方特比萘芬納米乳在皮膚刺激性試驗(yàn)、皮膚急性毒性試驗(yàn)和皮膚過敏性試驗(yàn)中，對家兔完整皮膚和破損皮膚無明顯刺激反應(yīng)，對豚鼠無皮膚過敏反應(yīng)，對家兔無明顯急性毒性反應(yīng)，說明本制劑毒性甚小，是一種安全性較好的外用制劑。

納米乳制劑促進(jìn)特比萘芬經(jīng)皮滲透的作用可能與以下兩方面因素有關(guān)：一是納米乳劑型本身有促進(jìn)藥物透皮吸收的特點(diǎn)［7－8］；二是納米乳的組成成分有促透作用，復(fù)方特比萘芬納米乳的組成成分包括IPM，IPM本身就是一種常用的滲透促進(jìn)劑［9］。

本研究對復(fù)方特比萘芬納米乳進(jìn)行了安全性及透皮能力的考察，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。由于本制劑是特比萘芬的一種全新藥物劑型，因此需進(jìn)行全面的臨床療效驗(yàn)證，考察其治療疾病效果，期望為獸醫(yī)臨床提供一種安全可靠、高效的治療皮膚病的新型納米藥物。

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