四君子湯對脾虛大鼠空腸黏膜損傷的修復作用及機制

劉發強，何玉英，李杰峰，張挪威，昝軍蘭，劉鳳華，許劍琴

（1．中國農業大學動物醫學院中獸醫實驗室，北京 海淀100193；2北京農學院動物科技系，北京 昌平102206）

中（獸）醫脾虛證多表現消化系統功能障礙，證見完谷不化，食后作瀉，大便稀溏，消瘦等。近年來研究表明，脾虛證患者和大鼠模型的胃腸道組織會出現病理變化，如胃黏膜變薄，小腸絨毛損傷、萎縮，細胞器非正常變化等［1］。當腸黏膜損傷時，機體啟動一系列反應保證黏膜結構的完整性，其中一個重要的反應是腸組織再生，這是由腸干細胞參與的非常復雜的過程。細胞增殖標記物－增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，簡稱 PCNA）是DNA聚合酶的重要輔助因子，常作為評價細胞增殖狀態的重要指標［2］。腸道隱窩干細胞的分裂狀態作為評價指標。PCNA生長因子可以調節多種細胞的增殖、移行和分化，在維持腸黏膜穩態及其結構完整性方面發揮著重要作用［3］。有研究表明，胰島素 樣 生 長 因 子－1（insulin－like growth factor－1，IGF－1）可以加速腸黏膜損傷后的修復過程［4］。

四君子顆粒由黨參、白術、茯苓和甘草四味中藥組成，是治療脾虛證的經典方劑。目前已有研究表明，四君子湯對大鼠和小鼠小腸免疫功能、胃腸運動等生理活動有重要調節作用［5－6］，但在脾虛動物腸黏膜損傷修復過程中作用研究甚少。空腸是食物消化、吸收的主要部位，為此，本試驗檢測空腸中PCNA和IGF－1的表達，探討經典方劑四君子湯對脾虛大鼠空腸修復過程的影響，為中獸醫脾虛證之實質、四君子湯的藥理作用機制和臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 藥物及主要試劑、設備 成年SD雄性大鼠24只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。利血平注射液（1mg／mL），購自廣東邦民制藥有限公司。四君子顆粒（黨參、白術、茯苓和炙甘草），購自湖北武當生物制藥有限公司。石蠟（Sigma公司，美國）；蘇木精、伊紅（Sigma公司，美國）；乙醇、二甲苯（北京化工廠）；兔抗大鼠PCNA多抗（北京博奧森生物技術有限公司）；兔抗大鼠IGF－1單抗（Santa Cruz，美國）；兔抗體免疫組化試劑盒（南京凱基生物技術發展有限公司）；BH2型生物顯微鏡（Olympus，日本）。

1．2 動物分組、處理和樣本采集 試驗大鼠24只適應性飼養3d后，隨機分為對照組、脾虛組、四君子顆粒治療組和治療對照組，每組6只。試驗第1～7天，脾虛組、四君子顆粒治療組和治療對照組大鼠以0．5mL／kg體重［7］劑量腹腔注射利血平，對照組以相同劑量和方法注射生理鹽水。試驗第8天，處死脾虛組和對照組所有大鼠，每只大鼠取空腸中段5cm，置于4%中性甲醛溶液固定，用于制作石蠟切片。四君子顆粒治療組于試驗第8天開始每天灌服濃度為0．5g／mL的四君子顆粒，8mL／kg·d（劑量根據人和大鼠體重換算，系數為0．018［l8］；四君子顆粒用蒸餾水溶解），治療對照組灌服相同劑量生理鹽水，連續5d，于試驗第13天處死兩組大鼠，采樣及樣本處理和保存方法同脾虛組。

1．3 空腸組織H．E．染色 石蠟切片經二甲苯常規脫蠟，二甲苯∶無水酒精（1∶1）、無水酒精95%～50%下行梯度酒精中各5min，蘇木精染色約10 min，蒸餾水沖洗、0．5%鹽酸分色后，自來水沖洗藍化30min，經蒸餾水沖洗、酒精脫水上行至95%后，放入0．5%伊紅酒精染液染色30s，再依次入95%酒精、無水酒精、二甲苯，最后用中性樹膠封片。

光鏡下觀察比較各組大鼠腸黏膜形態結構的變化，采用Image－Pro Plus 5．1 圖像分析系統，測量空腸絨毛長度、隱窩深度，每個腸道組織切片選取5視野進行統計，取其平均值。

1．4 PCNA和IGF－1免疫組織化學法染色 常規方法制作石蠟切片，切片厚度4μm。（1）常規脫蠟水合。二甲苯5min洗2次，二甲苯∶無水乙醇（1∶1）5min洗1次，無水乙醇5min洗2次，95%、90%、80%、70%、50%的乙醇各5min洗1次，ddH2O 5min洗1次，PBS 5min洗3次。（2）抗原修復。用檸檬酸鈉緩沖液（pH值6．0）于微波爐中煮沸（高火5min，中低火3min 3次）。修復后，組織切片自然涼至室溫。（3）封閉內源性過氧化物酶3%H2O2室溫孵育20min。PBS中5min洗3次。（4）1%山羊血清37℃封閉20min。（5）一抗孵育。組織切片于200倍稀釋的抗體溶液中4℃孵育過夜。PBS中5min洗3次。（6）在抗兔生物素化二抗中，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。（7）在鏈親和素標記 HRP溶液中，37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5min。（8）DAB顯色2～5 min，顯微鏡下掌控。ddH2O洗3次，每次5min。（9）蘇木精復染10min，1%鹽酸酒精分化，脫水、透明后，中性樹膠封片。

每組中隨機選取3只大鼠的切片，每個切片高倍鏡下隨機選取5個視野，觀察染色情況。PCNA染色結果以空腸每個隱窩PCNA陽性細胞數表示；IGF－1染色結果以平均每個視野的IGF－1陽性細胞數表示。

1．5 統計學處理 用SPSS Statistics 17．0統計軟件，顯著性分析采用t檢驗，結果以平均值±標準差表示。

2 結果

2．1 臨床觀察 脾虛組、四君子顆粒治療組和治療對照組大鼠在試驗第3天出現精神倦怠、蜷縮，飲食、飲水量下降；試驗第5天出現體重降低、肛門污穢、大便稀溏、被毛凌亂等癥狀。停止注射利血平至第13天取樣前，四君子顆粒治療組大鼠的精神狀態、體重、飲食、飲水恢復程度明顯好于治療對照組。

2．2 大鼠空腸形態學觀察 H．E．染色后觀察，脾虛組大鼠空腸絨毛頂端表皮脫落，絨毛、隱窩萎縮。四君子顆粒治療組的絨毛高度、隱窩深度顯著高于治療對照組（P＜0．05）；兩組空腸絨毛頂端損傷現象基本消失。見圖1、2。

2．3 PCNA的免疫組化檢測 中插彩版圖3和表1結果顯示，PCNA在4組大鼠空腸中都有表達。每個隱窩PCNA陽性細胞數脾虛組極顯著少于對照組（P＜0．01）；四君子顆粒治療組顯著多于治療對照組（P＜0．05）。

2．4 IGF－1的免疫組化檢測 表1結果顯示，大鼠空腸中IGF－1陽性細胞數脾虛組極顯著少于對照組（P＜0．01）；四君子顆粒治療組極顯著多于治療對照組（P＜0．01）。

圖1 空腸絨毛長度變化 圖2 空腸隱窩深度變化

表1 空腸PCNA和IGF－1免疫組化染色結果

3 討論

脾虛證動物模型建立有多種方法，譬如苦寒瀉下法、耗氣破氣法、利血平注射法，其中利血平注射法是比較常用和成熟的方法之一［9］。注射利血平后，大鼠出現行為障礙以及副交感神經抑制所致體溫降低等癥狀［10］；本試驗中，可見大鼠精神委靡，飲食、飲水、體重下降，大便稀溏，被毛凌亂，蜷縮等癥狀，與Zhao Ning等［10］人建立的大鼠脾虛模型癥狀表現基本一致。

胃腸道結構損傷是脾虛動物表現消化道癥狀的重要原因。王清等［11］人用大黃煎液灌胃的方法建立脾虛大鼠模型后，觀察模型大鼠小腸的病理學變化，腸絨毛萎縮甚至消失，黏膜上皮壞死，小腸腺破壞嚴重；黏膜層可見較多的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞及嗜中性粒細胞。本試驗以利血平建立的脾虛大鼠模型可見空腸絨毛尖端表皮細胞脫落，絨毛、隱窩萎縮等現象。

韓凌等［12］研究了四君子湯總多糖對大鼠小腸上皮株IEC－6細胞增殖的影響，結果表明，四君子湯總多糖無論對正常生長細胞或對生長受到抑制的細胞都具有促進增殖的作用。增殖細胞核抗原（PCNA），是真核細胞DNA聚合酶δ的推動因子，協調DNA復制過程。它的出現與細胞周期中DNA合成期（S期）密切相關［13］。PCNA可作為細胞增殖標志，反映細胞分裂增殖的狀態。在PCNA免疫組織化學法染色試驗中，可以著色的腸道隱窩細胞有隱窩干細胞、增殖放大細胞［14］。本試驗中，脾虛組大鼠空腸隱窩中PCNA陽性細胞數顯著減少，說明脾虛大鼠隱窩干細胞、增殖放大細胞的分裂速度明顯降低，導致了脾虛組空腸絨毛和隱窩的萎縮。四君子顆粒治療組空腸隱窩中PCNA陽性細胞數顯著高于治療對照組，可見四君子顆粒能夠促進隱窩干細胞、增殖放大細胞分裂增殖。由此表明，脾虛狀態下大鼠空腸隱窩中具有分裂增殖能力的細胞處于抑制狀態，四君子顆粒能夠有效地逆轉這種狀態。

生長因子在腸黏膜修復過程中扮演重要角色，可以通過促進腸上皮細胞的移行、增殖和分化，參與胃腸道上皮的重建過程。IGF－1是眾多生長因子中的一員，在體外試驗中IGF－1可以2～2．5倍地促進腸上皮細胞的移行，對腸上皮細胞增殖有明顯促進作用［14］。本試驗中脾虛組IGF－1表達顯著降低，四君子顆粒能夠明顯促進大鼠空腸中IGF－1的表達，提示脾虛狀態下腸黏膜的萎縮與IGF－1等生長因子的低表達有關，四君子顆粒能夠提高腸道組織修復相關因子IGF－1的表達，有助于腸道損傷后的修復重建過程。

綜上所述，脾虛證所見消化系統功能障礙與小腸黏膜損傷及其再生修復功能異常密切相關，四君子（顆粒）湯能夠提高脾虛大鼠空腸隱窩干細胞的增殖能力和腸黏膜修復重建相關因子IGF－1表達，有助于脾虛動物腸黏膜再生修復，改善和恢復消化系統功能。

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