馬耳他布魯菌omp25的原核表達與免疫原性檢測

吳 杰，吳樹清，李東興，劉艷琴，張明月，海 巖

（1.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古疾病預防控制中心，內蒙古 呼和浩特 010018）

布魯菌病是由布魯菌屬細菌引起的動物源性疾病，是一種人畜共患傳染性疾病，該病在我國發病呈逐年上升趨勢［1］。它主要引起人類波狀熱和慢性感染以及反芻動物流產和睪丸炎等，目前尚無根治方法。大量研究表明，布魯菌的外膜蛋白具有很強的免疫原性［2-3］。omp25是布魯菌ompA家族成員之一，omp25基因在布魯菌各個種屬之間有很高的保守性［4］。本試驗克隆了馬耳他布魯菌omp25基因，在大腸埃希菌Rosetta中表達，用純化的表達產物進行Western-blot分析，發現重組蛋白具有免疫原性。為檢測布魯菌病及研制布魯菌亞單位疫苗提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 馬耳他布魯菌為內蒙古農業大學微生物實驗室分離株。pET-32a、Rosetta購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑 T4連接酶，DNA Marker、蛋白Marker、IPTG和限制性內切酶Eco RⅠ、Xho lⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗羊IgG，購自Sigma公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，濃度2OD／管，儲存液濃度100μmol／L。羊種布魯菌陽性血清和標準陰性血清由本實驗室保存，其他常規試劑均為國產試劑。

1.3 目的片段的擴增 根據GenBank上發表的M16布魯菌的omp25的基因序列設計馬耳他布魯菌上下游引物P1：5′cgcctcgagttagaacttgtagt 3′，P2：5′ccgggatccatgaaatccgtaat 3′（分別加入Eco RⅠ和Xho lⅠ酶切位點）。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，94℃變性40s，55℃復性45s，72℃延伸45s；30個循環，最后72℃延伸10min。同時設去離子水對照。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結果。

1.4 omp25基因表達載體的構建 PCR產物經限制性內切酶Eco RⅠ、Xho lⅠ雙酶切處理，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收預期的omp25基因片段與同樣處理的pET-32a表達載體16℃連接過夜，轉化至Rosetta中，涂LB平板（氨芐青霉素和氯霉素抗性），37℃培養過夜，挑取單克隆菌落37℃過夜搖菌，堿變性法提取質粒，進行PCR和Eco RⅠ、Xho lⅠ雙酶切鑒定。挑取陽性單克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，并與GenBank報道的omp25基因序列進行同源性比較。將重組質粒命名為pET-32a-omp25。

1.5 pET-32a-omp25重組蛋白的誘導表達 含重組質粒的菌液按1∶100的量接種在LB培養基中（含氨芐青霉素，氯霉素50μg／mL），37℃振蕩培養至OD600值約為0.6～1.0，再加入IPTG使其終濃度達到1mmol／L。37℃繼續培養，經12%分離膠檢測表達情況。

1.6 表達產物的純化和Western-blot檢測 將上述的誘導表達樣品以10000r／min離心收集菌體，沉淀物用原收集菌液量1／5體積的PBS懸浮，置冰浴中超聲波處理10min，10000r／min（4℃）離心10 min，分別收集上清和沉淀。按照His GraviTrap和His GraviTrap Kit的說明書，對融合蛋白進行重力流純化，對純化產物進行SDS-PAGE分析。將純化蛋白經SDS-PAGE后再轉到NC膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，PBST緩沖液洗3次，加入布魯菌病陽性血清（1∶100倍稀釋）37℃作用2h，PBST緩沖液洗3次，再加入兔抗羊IgG辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體（1∶2000倍稀釋），37℃作用1h，PBST緩沖液洗3次，DAB顯色液中避光顯色2～10min。

2 結果

2.1 pET-32a-omp25重組質粒的鑒定 pET-32aomp25重組質粒經PCR和Eco RⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，得到了預期大小的642bp片段。測序結果表明，目的基因omp25正向插入pET-32a載體（見圖1）。

圖1 重組質粒pET-32a-omp25的PCR及雙酶切鑒定

2.2 表達產物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE分析結果表明，經1mmol／L的IPTG誘導的5h基因工程菌獲得表達，產生約43kDa的特異性蛋白條帶（見圖2）。

圖2 表達產物的SDS-PAGE

2.3 表達產物的純化及Western-blot檢測結果純化產物經SDS-PAGE電泳分析表明獲得了高純度的目的蛋白。Western-blot分析結果表明，表達的目的蛋白能與馬耳他布魯菌陽性血清發生特異性反應，43kDa處出現特異免疫反應條帶（見圖3）。

圖3 表達產物純化的SDS-PAGE及Western-blot分析

3 討論

omp25是布魯菌外膜結構蛋白［5］，是具有代表性的第3組外膜蛋白［6］。在布魯菌各個種屬之間具有高度的保守性，同源性達98%以上。布魯菌omp25基因的缺失可引起布魯菌的毒力減弱，并能夠對宿主起到免疫保護作用［7］。Philpper從B.abortus544基因庫中，以抗omp25單克隆抗體調出了omp25基因，并分析了其脫氧核糖核苷酸序列omp25基因長約917bp，在起始密碼子6個堿基前有7個核苷酸序列（TAAGGAG）與大腸桿菌16sRNA序列具有同源性，估計是核糖體結合位點。布魯菌細胞壁膜結構是大多數細菌識別宿主的獨特標志物，能綁定胞外的許多基質蛋白，特別是纖維連接素和玻璃體粘連蛋白，這也是許多其他的病原微生物普遍存在的一個屬性。研究證實布魯菌表面主要的抗原成分是LPS和omps。到目前為止，己發現有7種主要omps［8］，它以共價鍵的形式與細胞外膜的膚聚糖（PG）層緊密結合。

本試驗證實omp25蛋白表達量高，占總菌體蛋白的含量高，具有良好的免疫反應原性，具備作為免疫學活性抗原的潛力和優勢，為疫苗的開發和免疫學檢測方法的建立提供了候選抗原。

［1］文學忠，于瑞華，姜秋杰.布魯氏菌病近況［J］.吉林畜牧獸醫，2007，5：20-23.

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［5］Bowden R A，Verger J M，Grayon M，et al.Rspid identification of rough Brucella isolates bu a latex coagglutination assay with the 25-lilodalton outer membrane protein and rough-lipopolysaccharide specific monoclonal antibodies［J］.Clin Diagn Lsb Innunol，1997，4（5）：611-614.

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