豬鏈球菌河北分離株對常用抗菌藥物的耐藥性

芮 萍，陳翠珍，段玲欣，王秋悅，楊彩然，馬增軍

（河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島066600）

豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)引致豬鏈球菌病最主要的病原，由該菌引起的豬鏈球菌病在所有養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家均有報道，并引起廣泛流行，且人通過特定的傳播途徑亦可感染該菌。如何防止該病的發(fā)生和傳播，是當前豬病防控的一項重要課題。化學(xué)藥物的治療是控制該病的有效手段，但隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床中病原菌的耐藥現(xiàn)象也日趨嚴重，據(jù)國內(nèi)外文獻報道，豬源鏈球菌尤其對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類及磺胺類抗菌藥物耐藥性最為嚴重［1－4］。為了解細菌耐藥情況并制定合理的治療方案，本試驗選擇8類28種獸醫(yī)臨床常用藥物，對臨床分離的豬鏈球菌做體外抗菌活性測定，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 34株供試菌株均為2001～2010年分離自河北省各地區(qū)的病死豬肺臟、脾臟、腎臟、心血、腦以及關(guān)節(jié)液等，經(jīng)PCR鑒定為豬鏈球菌，其中22株SS2，1株SS7，2株SS9，9株未定型。金黃色葡萄球菌ATCC29213為標準質(zhì)控菌株，購自中國藥品生物制品檢定所。所有菌株置于30%甘油肉湯中，－20℃保存。

1.2 培養(yǎng)基 MHB、MHA培養(yǎng)基均為北京陸橋技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品，用于藥敏試驗，臨用前均添加5%犢牛血清（杭州四季青公司），并用參考菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213進行質(zhì)控，不符合要求者則淘汰。

1.3 抗菌藥物 β－內(nèi)酰胺類抗生素：青霉素G、阿莫西林、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢噻呋。磺胺類藥物：磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、三甲氧芐氨嘧啶。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素：紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、替米考星、泰樂菌素。喹諾酮類抗菌藥：環(huán)丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星。林可胺類抗生素：林可霉素、克林霉素。四環(huán)素類抗生素：四環(huán)素、強力霉素。酰胺醇類：氯霉素、氟苯尼考。氨基糖苷類抗生素：鏈霉素、阿米卡星，慶大霉素。以上藥品配制成一定濃度后于－20℃保存，臨用前稀釋為使用濃度。

1.4 體外最小抑菌濃度測定 嚴格按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI，2008）推薦的標準微量稀釋法進行試驗操作和結(jié)果判斷［5－6］，每菌增菌至108CFU／mL，然后稀釋為105～106CFU／mL，接種于含不同藥物濃度的96孔板中，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。檢測結(jié)果判定按NCCLS標準執(zhí)行，只有當陽性對照孔（不含抗生素）孔內(nèi)細菌有明顯生長，加樣孔透明或孔底的沉淀不大于2mm稀釋度孔，才是該藥的MIC。對所測得的MIC結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，得出MIC50、MIC90及 MIC范圍，并計算細菌對各抗菌藥的耐藥率（包括中介菌株）、抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 β－內(nèi)酰胺類抗生素體外抑菌活性 見表1。

表1顯示：β－內(nèi)酰胺類抗生素對受試菌株敏感率較高，頭孢噻呋對臨床分離的34株豬鏈球菌的作用最好，抑菌率達85.3%（29／34），其次阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻吩和頭孢唑啉鈉抑菌效果也較好，抑菌率分別達76.5% （26／34）、76.5% （26／34）、82.3% （28／34）、82.3% （28／34），MIC50均≤2g／mL，青霉素G對測試菌株的抑菌效果相對較差，抑菌率為64.7%（22／34）。另外，所選各藥均對早期分離的豬鏈球菌有較強的抑菌效果。

表1 β－內(nèi)酰胺類抗生素對臨床分離豬鏈球菌的體外抑菌活性

2.2 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素體外抑菌活性 見表2。臨床分離的豬鏈球菌對所選5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中，除替米考星耐藥率為50% （17／34）外，測試菌株對紅霉素、泰樂菌素、羅紅霉素、阿奇霉素均產(chǎn)生較強的耐藥性，耐藥率分別為88.2%（30／34）、88.2%（30／34）、76.5%（26／34）、73.5%（25／34），其 MIC50范圍為16～64μg／mL，MIC90均為256μg／mL，且高度集中在高耐藥區(qū)。

表2 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對臨床分離豬鏈球菌的體外抑菌活性

2.3 喹諾酮類抗菌藥體外抑菌活性 見表3。在所選的喹諾酮類抗菌藥中，環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星對所分離的豬鏈球菌表現(xiàn)為較好的抗菌活性，其抑菌率分別為61.8%（21／34）、58.8%（20／34）、58.8%（20／34），而諾氟沙星和培氟沙星的效果較差，抑菌率分別為29.4%（10／34）和26.5%（9／34）。

表3 喹諾酮類抗菌藥對臨床分離豬鏈球菌的體外抑菌活性

2.4 磺胺類藥物體外抑菌活性 見表4。臨床常用的磺胺類藥物對所有豬鏈球菌抗菌作用極差，菌株對其表現(xiàn)出高度耐藥性，所測試的磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑和甲氧芐啶對34株分離菌株的敏感率均低于20%，其 MIC50，MIC90均為1 024μg／mL，且高度集中在高耐藥區(qū)，相差不超過一個稀釋倍數(shù)。

表4 磺胺類藥物對臨床分離豬鏈球菌的體外抑菌活性

2.5 其他類抗生素體外抑菌活性 見表5。表5結(jié)果顯示，四環(huán)素類抗生素、林可胺類抗生素、氨基糖甙類抗生素對臨床所分離的豬鏈球菌抗菌作用極差，四環(huán)素、強力霉素、林可霉素和克林霉素對所測的34株豬鏈球菌的抑菌率分別為2.9%、11.8%、14.7%、20.6%。氟苯尼考、氯霉素對所有測試菌株表現(xiàn)為較好的抗菌活性，其抑菌率分別為67.6%、58.8%。

2.6 34株豬鏈球菌對8類抗菌藥物耐藥譜分析 藥物敏感試驗結(jié)果顯示（表6），34株檢測菌株全部為耐藥菌，并以多重耐藥為主。在所測得的34株細菌中，91.18%的菌株對3種以上藥物耐藥，其中以4耐、5耐最多，占 23.53%、20.59%；9 耐也居多，占17.65%，6耐、7耐和8耐均占8.82%。各多重耐藥菌耐藥譜也不盡相同，34株細菌對9種藥物可形成14種耐藥譜型，其中以9藥耐藥譜型紅霉素－克林霉素－四環(huán)素－磺胺甲基異惡唑－阿米卡星－頭孢唑啉－青霉素－環(huán)丙沙星－氯霉素為最多，占所有耐藥譜型的17.65%，其次為5藥耐藥譜型紅霉素－克林霉素－四環(huán)素－磺胺甲基異惡唑－阿米卡星，約占14.7%。

表5 其他類抗生素對臨床分離豬鏈球菌的體外抑菌活性

3 討論

研究結(jié)果顯示，臨床中分離的菌株多以耐藥菌為主，而且大都呈多重耐藥，尤其對磺胺類藥物、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類、氨基苷類藥物耐藥性最為嚴重，耐藥非常普遍，且多為高度耐藥；對喹諾酮類藥物、酰胺醇類的耐藥性次之；對青霉素類、頭孢菌素類仍保存良好的敏感性，但鏈球菌對青霉素的中介（低度耐藥）率較高，有發(fā)展成高度耐藥株的趨勢，這些數(shù)據(jù)表明，本次分離的豬鏈球菌的耐藥性與國外的報道有明顯的不同，對大環(huán)內(nèi)酯類、β－內(nèi)酰胺類、林可胺類抗生素的耐藥性顯著高于瑞典、丹麥、日本等國家分離的鏈球菌［2－3］，這與我國在豬病預(yù)防治療上使用以上抗生素，并在飼料中添加四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素有著密切的聯(lián)系。所以臨床用藥上分析，青霉素作為高效、低毒的殺菌藥物，仍對鏈球菌保持良好的效果，依然是臨床用藥的主要治療藥物。其次選擇頭孢菌素類、喹諾酮類藥物等藥物作為輔助治療。

對耐藥菌株進一步分析34株檢測菌株以多重耐藥為主。在所測得的34株細菌中，91.18%的菌株對3種以上藥物耐藥，其中以4耐、5耐和9耐也居多，多重耐藥大多為紅霉素、克林霉素、四環(huán)素和磺胺類，4種藥物同時耐藥的菌株為23株，占4耐以上菌株總數(shù)的67.6%，由此可見，對4種常用藥物的多重耐藥情況己相當嚴重。分析臨床豬鏈球菌菌株耐藥性產(chǎn)生的原因，除抗菌藥物長期應(yīng)用導(dǎo)致的“選擇性壓力”篩選和抗菌藥物的不合理使用外，耐藥基因在菌株中的廣泛傳播至關(guān)重要。

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