幾種檢測弓形蟲血清抗體方法的比較分析

劉 帥，王貝貝，崔麗麗，靳興軍，張 躍，沈光年，汪 明

（1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 國家動物原蟲實驗室，北京 海淀100193；2.北京市獸醫(yī)實驗診斷所，北京 朝陽100101）

弓形蟲是一種人畜共患的細胞內寄生原蟲，在人和動物的各種有核細胞內都可寄生與繁殖。對人類健康和畜牧業(yè)生產均造成重大威脅。應用血清學技術檢測特異的抗體仍然是診斷弓形蟲感染的主要手段。但目前國內外商品化的檢測試劑盒檢測效能差異頗大，難以判定其真實性［1］。本實驗室對國內間接血凝試驗（IHA）、間接ELISA、SPA－ELISA 弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒和本實驗室自建的改良凝集試驗（MAT）進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 血清 2010年8月采自北京順義與大興區(qū)豬場的80份血清樣本。由北京市獸醫(yī)實驗診斷所提供。

1.2 檢測試劑和試劑盒 改良凝集試驗（MAT）試劑由本實驗室自制。參照Dubey［2］等人1987年發(fā)明的改良凝集試驗方法，改進速殖子純化條件，優(yōu)化檢測所需弓形蟲速殖子抗原量，固定速殖子全蟲為診斷抗原液。血清凝集效價1∶25以上者判為陽性。

間接血凝試驗（IHA）試劑，購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。生產批號：20110529。

間接ELISA試劑盒，購自深圳康百得生物技術有限公司：豬弓形蟲抗體檢測試劑盒。生產批號：20110613。檢測時所有血清分為兩個稀釋度1∶100與1∶200，稱為ELISA－100，ELISA－200。

SPA－ELISA試劑盒，購自珠海海泰生物制藥有限公司，動物弓形蟲IgG抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。生產批號：20110501。

1.3 檢測試驗 采集的血清樣本用上述試劑或試劑盒進行了平行檢測，試驗操作及結果判定按試劑盒說明書進行。

陽性樣本標準：參照全國第二屆弓形蟲病學術討論會（武漢，1993.11）推出的診斷方案［3］，有3次或以上檢測結果為陽性者判定為陽性標準樣本。

1.4 評價指標 符合率：兩種方法檢測結果一致的樣本數(shù)與檢測總樣本數(shù)之比；敏感性：對陽性標準樣本檢測為陽性的概率；特異性：對陰性樣本檢測為陰性的概率；檢測效率：檢測結果符合實際情況的樣本數(shù)與總檢測樣本數(shù)之比；Youden指數(shù)：敏感性＋特異性－1，Youden指數(shù)檢驗采用U檢驗式［4］。

2 結果

2.1 平行檢測血清結果 平行檢測80份樣品，ELISA－100檢出陽性57份；ELISA－200檢出陽性21份；SPA－ELISA檢出陽性21份；IHA檢出陽性17份；MAT檢出陽性18份。5次檢測的血清陽性率分別為：71.3%，26.3%，26.3%，21.3%，22.5%。見表1。經(jīng)χ2檢驗，ELISA－100檢測血清抗體陽性率（71.3%）高于其他4種方法檢測的血清陽性率（21.3%～26.3%），且差異極顯著（P＜0.01）。ELISA－200、SPA－ELISA、IHA、MAT 4種方法檢測的血清陽性率之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 平行檢測豬血清結果

2.2 平行檢測結果之間的符合率 平行檢測的5次結果中，ELISA－100檢測結果與其他檢測結果符合率較低（＜55%），其他4次檢測結果相互之間的符合率都在70%以上，其中ELISA－200與IHA檢測結果符合率最高，為87.5%。見表2。經(jīng)配對卡方檢驗，ELISA－100與其他4種方法檢測結果具有極顯著差異（P＜0.01）。ELISA－200、IHA、MAT、SPA－ELISA 4種方法檢測結果兩兩之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 5種方法檢測結果符合率 （%）

2.3 各檢測方法的敏感性、特異性、檢測效率及Youden指數(shù) 在平行檢測的80份血清樣本中，符合陽性標準的樣本共20份。5次檢測中ELISA－200的敏感性（90%）、特異性（95%）和檢測效率（93.75%）均在90%以上，Youden指數(shù)為0.85，顯著高于其他4種方法。其次是IHA，敏感性稍低（50%），特異性和檢測效率都達到90%以上，Youden指數(shù)屬于中等。本實驗室自建的MAT方法敏感性稍低（50%），特異性較好，為88.3%，檢測效率為 81.25%，Youden指數(shù)為 0.483。SPAELISA敏感性、特異性和檢測效率屬于中等，Youden指數(shù)為 0.45；ELISA－100 敏感性高，為100%，但是特異性低，僅38.3%，檢測效率和Youden指數(shù)顯著低于其他方法。見表3。

3 討論

隨著對弓形蟲研究的不斷發(fā)展和深入，新的診斷技術不斷被開發(fā)和建立，目前國內外弓形蟲感染的診斷技術已經(jīng)超過10多種，包括一些分子生物學診斷技術［5］。但由于弓形蟲感染的特點，在弓形蟲感染的診斷中，免疫學方法仍占有極重要的地位，MAT、ELISA、IHA都是廣泛應用在弓形蟲感染診斷和流行病學調查中的血清學方法。改良凝集試驗（MAT）是20世紀80年代，Dubey和Desmonts建立的［2］，是特異敏感的檢測方法［6］，迄今一直在歐美各國廣泛應用于動物和人弓形蟲病的流行病學調查［7－8］。間接血凝試驗（IHA）操作簡便快速，作為我國全國性的人、畜弓形蟲病流行病學調查方法而被普遍使用。ELISA具有高敏感性和特異性、易于標準化，是目前診斷弓形蟲發(fā)展最快、應用最廣的技術［9］。

表3 5種方法的敏感性、特異性、檢測效率和Youden指數(shù)

近來年弓形蟲檢測方法逐漸增多，市場上也有多家生產廠商的檢測試劑盒產品，但我們前期的試驗結果顯示，不同檢測方法，不同生產廠家，甚至不同生產批號的檢測試劑盒檢測的結果都有較大差異。張述義等人［1，10－12］對國內外一些檢測試劑盒進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)這些試劑盒檢測結果也有顯著差異。Mainar－Jaime等人的研究也指出，檢測方法的差異大小隨被檢動物的不同而不同，需根據(jù)被檢動物的不同而評估使用的檢測方法［13］。因此我們在開展大規(guī)模的流行病學調查前必須對各種方法進行比對，從中選擇檢測效率相對高的方法開展普查，最大限度的使調查結果貼近真實。另外，對于陽性樣品最好還要用另一種方法進行復核。

本試驗選擇3種市場中的弓形蟲抗體檢測試劑盒：深圳康百得的豬弓形蟲抗體檢測試劑盒，珠海海泰的動物弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒，蘭州獸醫(yī)研究所的弓形蟲間接血凝試劑盒，還有本實驗室自建的改良凝集試驗檢測方法，對其進行了比較分析。

評價檢測方法的指標除了常用的檢測效率，還增加了Youden指數(shù)。Youden指數(shù)是分析敏感性和特異性的綜合評價指標，可以避免對于敏感性和特異性的偏移，較客觀的反映實際情況［4，14］。

深圳康百得豬弓形蟲抗體檢測試劑盒建議血清稀釋倍數(shù)為100倍，但是在試驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，100倍稀釋檢測的結果與其他3種方法檢測結果具有極顯著性差異，檢測效率和Youden指數(shù)顯著低于其他方法，檢測價值低。我們加大血清稀釋倍數(shù)，改為200倍，檢測結果與其他3種方法無顯著性差異。敏感性，特異性和檢測效率都到達90%以上，Youden指數(shù)達到0.85。可以用來進行大規(guī)模的流行病學調查和臨床診斷。本實驗室自建的MAT方法，與 ELISA－200，IHA，SPA－ELISA 平行檢測血清樣本，經(jīng)配對卡方檢驗，與上述三種方法檢測結果之間沒有顯著性差異。敏感性為60%，特異性高為88.3%，檢測效率為81.25%，可為初步血清學篩查后核實陽性樣本所用。

［1］何艷燕，蔣守富，馬杏寶，等.國內外16種弓形蟲診斷試劑盒的評估［J］.旅行醫(yī)學科學，2008（3）：43－45.

［2］Dubey J P，Desmonts G.Serological responses of equids fed Toxoplasma gondii oocysts［J］.Equine Vet J，1987，19（4）：337－339.

［3］張述義，何艷燕，曹琳，等.檢測弓形蟲IgM抗體的3種試劑盒的比較分析［J］.中國人獸共患病雜志，2001（3）：72－74.

［4］陳平雁.診斷試驗的評價指標及其應用［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，1991（5）：53－57.

［5］王艷華，李學瑞，張德林，等.弓形蟲病診斷方法研究進展［J］.中國獸醫(yī)寄生蟲病，2008（1）：28－33.

［6］Dubey J P.Validation of the specificity of the modified agglutination test for toxoplasmosis in pigs［J］.Vet Parasitol，1997，71（4）：307－310.

［7］Dubey J P，Thulliez P，Romand S，etal.Serologic prevalence of Toxoplasma gondii in horses slaughtered for food in North America［J］.Vet Parasitol，1999，86（4）：235－238.

［8］Garcia－Bocanegra I，Simon－Grife M，Dubey J P，etal.Seroprevalence and risk factors associated with Toxoplasma gondii in domestic pigs from Spain［J］.Parasitol Int，2010，59（3）：421－426.

［9］Hill D E，Chirukandoth S，Dubey J P，etal.Comparison of detection methods for Toxoplasma gondii in naturally and experimentally infected swine［J］.Vet Parasitol，2006，141（1－2）：9－17.

［10］蔣守富，張述義，潘彩娥，等.5種市售弓形蟲抗體檢測試劑盒的評價［J］.中國人獸共患病雜志，2003（1）：97－99.

［11］張述義，魏梅雄，王龍英，等.改良凝集試驗（MAT）與間接血凝試驗（IHAT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測弓形蟲抗體的比較分析［J］.寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報，2001，8（4）：199－203.

［12］牛安歐，馮友仁，劉文琦.幾種弓形蟲ELISA試劑盒初步檢測結果比較［J］.中國人獸共患病雜志，2000（4）：56－58.

［13］Mainar－Jaime R C，Barberan M.Evaluation of the diagnostic accuracy of the modified agglutination test（MAT）and an indirect ELISA for the detection of serum antibodies against Toxoplasma gondii in sheep through Bayesian approaches［J］.Vet Parasitol，2007，148（2）：122－129.

［14］陳平雁，王斌會，莫一心.幾種診斷試驗統(tǒng)計方法的比較［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，1995（5）：8－11.