幾種檢測弓形蟲血清抗體方法的比較分析

劉 帥，王貝貝，崔麗麗，靳興軍，張 躍，沈光年，汪 明

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 國家動物原蟲實驗室，北京 海淀100193；2.北京市獸醫(yī)實驗診斷所，北京 朝陽100101）

弓形蟲是一種人畜共患的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，在人和動物的各種有核細(xì)胞內(nèi)都可寄生與繁殖。對人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)均造成重大威脅。應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)檢測特異的抗體仍然是診斷弓形蟲感染的主要手段。但目前國內(nèi)外商品化的檢測試劑盒檢測效能差異頗大，難以判定其真實性［1］。本實驗室對國內(nèi)間接血凝試驗（IHA）、間接ELISA、SPA－ELISA 弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒和本實驗室自建的改良凝集試驗（MAT）進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 血清 2010年8月采自北京順義與大興區(qū)豬場的80份血清樣本。由北京市獸醫(yī)實驗診斷所提供。

1.2 檢測試劑和試劑盒 改良凝集試驗（MAT）試劑由本實驗室自制。參照Dubey［2］等人1987年發(fā)明的改良凝集試驗方法，改進(jìn)速殖子純化條件，優(yōu)化檢測所需弓形蟲速殖子抗原量，固定速殖子全蟲為診斷抗原液。血清凝集效價1∶25以上者判為陽性。

間接血凝試驗（IHA）試劑，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。生產(chǎn)批號：20110529。

間接ELISA試劑盒，購自深圳康百得生物技術(shù)有限公司：豬弓形蟲抗體檢測試劑盒。生產(chǎn)批號：20110613。檢測時所有血清分為兩個稀釋度1∶100與1∶200，稱為ELISA－100，ELISA－200。

SPA－ELISA試劑盒，購自珠海海泰生物制藥有限公司，動物弓形蟲IgG抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。生產(chǎn)批號：20110501。

1.3 檢測試驗 采集的血清樣本用上述試劑或試劑盒進(jìn)行了平行檢測，試驗操作及結(jié)果判定按試劑盒說明書進(jìn)行。

陽性樣本標(biāo)準(zhǔn)：參照全國第二屆弓形蟲病學(xué)術(shù)討論會（武漢，1993.11）推出的診斷方案［3］，有3次或以上檢測結(jié)果為陽性者判定為陽性標(biāo)準(zhǔn)樣本。

1.4 評價指標(biāo) 符合率：兩種方法檢測結(jié)果一致的樣本數(shù)與檢測總樣本數(shù)之比；敏感性：對陽性標(biāo)準(zhǔn)樣本檢測為陽性的概率；特異性：對陰性樣本檢測為陰性的概率；檢測效率：檢測結(jié)果符合實際情況的樣本數(shù)與總檢測樣本數(shù)之比；Youden指數(shù)：敏感性＋特異性－1，Youden指數(shù)檢驗采用U檢驗式［4］。

2 結(jié)果

2.1 平行檢測血清結(jié)果 平行檢測80份樣品，ELISA－100檢出陽性57份；ELISA－200檢出陽性21份；SPA－ELISA檢出陽性21份；IHA檢出陽性17份；MAT檢出陽性18份。5次檢測的血清陽性率分別為：71.3%，26.3%，26.3%，21.3%，22.5%。見表1。經(jīng)χ2檢驗，ELISA－100檢測血清抗體陽性率（71.3%）高于其他4種方法檢測的血清陽性率（21.3%～26.3%），且差異極顯著（P＜0.01）。ELISA－200、SPA－ELISA、IHA、MAT 4種方法檢測的血清陽性率之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 平行檢測豬血清結(jié)果

2.2 平行檢測結(jié)果之間的符合率 平行檢測的5次結(jié)果中，ELISA－100檢測結(jié)果與其他檢測結(jié)果符合率較低（＜55%），其他4次檢測結(jié)果相互之間的符合率都在70%以上，其中ELISA－200與IHA檢測結(jié)果符合率最高，為87.5%。見表2。經(jīng)配對卡方檢驗，ELISA－100與其他4種方法檢測結(jié)果具有極顯著差異（P＜0.01）。ELISA－200、IHA、MAT、SPA－ELISA 4種方法檢測結(jié)果兩兩之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 5種方法檢測結(jié)果符合率 （%）

2.3 各檢測方法的敏感性、特異性、檢測效率及Youden指數(shù) 在平行檢測的80份血清樣本中，符合陽性標(biāo)準(zhǔn)的樣本共20份。5次檢測中ELISA－200的敏感性（90%）、特異性（95%）和檢測效率（93.75%）均在90%以上，Youden指數(shù)為0.85，顯著高于其他4種方法。其次是IHA，敏感性稍低（50%），特異性和檢測效率都達(dá)到90%以上，Youden指數(shù)屬于中等。本實驗室自建的MAT方法敏感性稍低（50%），特異性較好，為88.3%，檢測效率為 81.25%，Youden指數(shù)為 0.483。SPAELISA敏感性、特異性和檢測效率屬于中等，Youden指數(shù)為 0.45；ELISA－100 敏感性高，為100%，但是特異性低，僅38.3%，檢測效率和Youden指數(shù)顯著低于其他方法。見表3。

3 討論

隨著對弓形蟲研究的不斷發(fā)展和深入，新的診斷技術(shù)不斷被開發(fā)和建立，目前國內(nèi)外弓形蟲感染的診斷技術(shù)已經(jīng)超過10多種，包括一些分子生物學(xué)診斷技術(shù)［5］。但由于弓形蟲感染的特點，在弓形蟲感染的診斷中，免疫學(xué)方法仍占有極重要的地位，MAT、ELISA、IHA都是廣泛應(yīng)用在弓形蟲感染診斷和流行病學(xué)調(diào)查中的血清學(xué)方法。改良凝集試驗（MAT）是20世紀(jì)80年代，Dubey和Desmonts建立的［2］，是特異敏感的檢測方法［6］，迄今一直在歐美各國廣泛應(yīng)用于動物和人弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查［7－8］。間接血凝試驗（IHA）操作簡便快速，作為我國全國性的人、畜弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查方法而被普遍使用。ELISA具有高敏感性和特異性、易于標(biāo)準(zhǔn)化，是目前診斷弓形蟲發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的技術(shù)［9］。

表3 5種方法的敏感性、特異性、檢測效率和Youden指數(shù)

近來年弓形蟲檢測方法逐漸增多，市場上也有多家生產(chǎn)廠商的檢測試劑盒產(chǎn)品，但我們前期的試驗結(jié)果顯示，不同檢測方法，不同生產(chǎn)廠家，甚至不同生產(chǎn)批號的檢測試劑盒檢測的結(jié)果都有較大差異。張述義等人［1，10－12］對國內(nèi)外一些檢測試劑盒進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)這些試劑盒檢測結(jié)果也有顯著差異。Mainar－Jaime等人的研究也指出，檢測方法的差異大小隨被檢動物的不同而不同，需根據(jù)被檢動物的不同而評估使用的檢測方法［13］。因此我們在開展大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查前必須對各種方法進(jìn)行比對，從中選擇檢測效率相對高的方法開展普查，最大限度的使調(diào)查結(jié)果貼近真實。另外，對于陽性樣品最好還要用另一種方法進(jìn)行復(fù)核。

本試驗選擇3種市場中的弓形蟲抗體檢測試劑盒：深圳康百得的豬弓形蟲抗體檢測試劑盒，珠海海泰的動物弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒，蘭州獸醫(yī)研究所的弓形蟲間接血凝試劑盒，還有本實驗室自建的改良凝集試驗檢測方法，對其進(jìn)行了比較分析。

評價檢測方法的指標(biāo)除了常用的檢測效率，還增加了Youden指數(shù)。Youden指數(shù)是分析敏感性和特異性的綜合評價指標(biāo)，可以避免對于敏感性和特異性的偏移，較客觀的反映實際情況［4，14］。

深圳康百得豬弓形蟲抗體檢測試劑盒建議血清稀釋倍數(shù)為100倍，但是在試驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，100倍稀釋檢測的結(jié)果與其他3種方法檢測結(jié)果具有極顯著性差異，檢測效率和Youden指數(shù)顯著低于其他方法，檢測價值低。我們加大血清稀釋倍數(shù)，改為200倍，檢測結(jié)果與其他3種方法無顯著性差異。敏感性，特異性和檢測效率都到達(dá)90%以上，Youden指數(shù)達(dá)到0.85。可以用來進(jìn)行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷。本實驗室自建的MAT方法，與 ELISA－200，IHA，SPA－ELISA 平行檢測血清樣本，經(jīng)配對卡方檢驗，與上述三種方法檢測結(jié)果之間沒有顯著性差異。敏感性為60%，特異性高為88.3%，檢測效率為81.25%，可為初步血清學(xué)篩查后核實陽性樣本所用。

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