鵝新城疫病例診斷報告

蔣運博，谷松至，杜東菊，王 新，董 浩，胡桂學

（1.吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春130118；2.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春130118）

1 發病情況

吉林省梅河口市某鵝場共飼養6 800只鵝，其中包括6 000只榔頭鵝的種鵝和800只吉林白鵝。本實驗室從該場購買了20只吉林白鵝。購買前此批鵝無任何發病跡象，經近5h的汽車運輸到達本校。自購買后次日開始，少數鵝出現食欲不振、精神委靡等癥狀，第5天后開始出現死亡。在購置這批鵝之前，該鵝場未曾有過關于疫情的報告，但在該鵝場周邊，有散養的雞和不明原因死去的雛鵝，死亡雛鵝未進行無害化處理和掩埋。該養殖場管理不夠嚴格，人員可自由出入。經同期調查，鵝場同批飼養的榔頭鵝與吉林白鵝也有少數發病。

2 臨床癥狀與病理剖檢

病鵝表現為逐漸消瘦，腳軟無力，行走搖擺不穩；頭縮頸軟，采食減少或廢絕；張口呼吸，甩頭；排黃綠色稀便，產軟殼蛋和畸形蛋。

隨機剖檢3只病死鵝發現，腺胃有明顯的滲出性出血；肝臟、腎臟、脾臟有不同程度的腫大、充血；氣管、腸道出血；胰臟腫大、質地硬而脆；卵黃流入腹腔、質地堅硬且形狀不規則。

3 實驗室診斷

3.1 細菌學檢驗 取鵝的肝臟和脾臟，涂片、染色、鏡檢，未見細菌。無菌操作取心血和肝臟，經普通營養瓊脂培養基、血瓊脂培養基和麥康凱培養基進行細菌的分離培養，結果均未分離到細菌。

3.2 病毒分離 取死亡鵝的肝臟和脾臟，用研缽研碎，以無菌PBS制成組織懸液，離心后取上清加入雙抗過夜。次日接種15只9日齡雞胚，24h內雞胚死亡2只，認為是操作失誤棄去；其余13只雞胚分別在48～72h內死亡，提取并保存雞胚尿囊液。觀察死亡雞胚，發現胚體全身充血，頭部和肢端尤為明顯，且有點狀出血。

3.3 病毒的鑒定

3.3.1 血凝試驗與血凝抑制試驗 將雞胚尿囊液倍比稀釋，與1%雞紅細胞懸液做血凝試驗，結果死亡雞胚混合尿囊液能凝集雞紅細胞，血凝效價為1∶32。取4個血凝單位雞胚尿囊液與雞新城疫、禽流感H5和H9陽性血清進行血凝抑制試驗，結果為新城疫病毒陽性血清血凝抑制試驗呈陽性。

3.3.2 RT－PCR鑒定 取病毒尿囊液按常規方法提取RNA，反轉錄后進行PCR鑒定。根據文獻［1］報道，合成新城疫強、弱毒鑒定引物。引物A＋B為針對NDV的通用引物，引物A＋C為針對NDV的強毒的引物，A＋D為針對NDV的弱毒的引物，引物序列及其位置如表1。

表1 引物的序列及其位置

PCR反應在25μL反應體系中進行：d NTP 2.0μL、ddH2O 17.2μL、模板cDNA 2.0μL、上下游引物各1.0μL、TaqDNA聚合酶0.3μL、10×PCR緩沖液2.5μL。反應條件為：95℃預處理4min，進行30個循環反應，每個循環反應包括：94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，循環完成后，72℃充分延伸10min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，在120V條件下電泳30min結果如圖1。

由圖1可見，3泳道出現目的條帶證明該病毒為新城疫病毒，2泳道出現目的條帶同時1泳道未見條帶，證明該病毒為新城疫強病毒。

圖1 PCR產物電泳圖

4 討論

通過對此批吉林白鵝的發病情況、臨床癥狀、病理剖檢的觀察，結合實驗室檢驗，確定造成此批白鵝死亡的病原為鵝新城疫病毒。

新城疫病毒基因組為單分子負鏈單股RNA，大小為15～16kb，包括六段基因，編碼6個主要的蛋白質，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一［2］，具有良好的免疫原性，是病毒毒力的主要決定因素。由于NDV毒力強弱與F蛋白裂解位點區112～117位氨基酸序列的組成有關，弱毒株在該區的氨基酸序列為GR（K）QGRL，強毒株為 RRQK（R）RF［3］。本試驗據此設計了 RT－PCR 引物［4－6］，此引物可以用于新城疫強、弱毒株的鑒定。根據RT－PCR結果推出，該場鵝攜帶的為新城疫強毒。通常認為鵝新城疫病毒不感染水禽，而水禽常作為其攜帶者，但不表現明顯的臨床癥狀。任濤等曾用新城疫病毒攻擊28日齡的鵝，未引起接種鵝發病和死亡［7］。因此推測引起此批白鵝發病的原因有以下幾點。首先，我國商品雞群中普遍存在ND強病毒。NDV污染雞場后，在病雞體內大量復制、循環，使毒力增強，并長期維持下去，一旦遇到免疫水平低的雞群或免疫力不足的雞，極易發生非典型ND，本批外購鵝受長途運輸、環境變化等各種應激因素影響導致鵝抵抗力下降，從而引發鵝體內新城疫病毒大量增殖；其次，雖然該鵝場內的成年鵝未見發病，但在鵝場周圍有不明原因死亡而隨便丟棄的未經無害化處理的雛鵝，同時周邊有散養雞的存在，因此此批鵝感染新城疫病毒可能與雞鵝混養有關；再次，該養殖場飼養管理不善，衛生條件差，各種人員可以自由出入，沒有完善的消毒措施，也可能是造成此批鵝感染新城疫病毒的原因。建議采取的防制措施為：加強運輸過程中的飼養管理條件，減小應激反應造成的發??；加強養殖場內的衛生管理措施，不但進鵝前進行徹底消毒，而且進鵝后也要定期消毒，平時應禁止所有可能帶毒的動物進入圈舍，并嚴格妥善處理病死畜禽；加強對人員的管理，出入時應進行嚴格消毒。

［1］Kant A，Koch G，van D J，etal.Differentiation of virulent and non－virulent strain of Newcastle disease viruswithin 24hours by polymerase chian reaction［J］.Avian Pathol，1997，26：837－849.

［2］劉成宏，金擴世，金寧一，等.新城疫強毒株F蛋白裂解位點串聯基因的構建及原核表達［J］.中國生物制品學雜志，2007，20（2）：73－76.

［3］Paterson R G，Shang hnessy M A，Lamb R A.Analysis of the relationship between cleavability of a paramyxovirus fusion protein and length of connecting peptide［J］.J Virol，1989，63：1293－1301.

［4］宋長緒，劉福安.新城疫病毒的分子生物學［J］.動物醫學進展，1998，19（1）：9－12.

［5］金擴世，金寧一，王興龍.新城疫病毒弱毒株分子生物學特性的研究［J］.中國預防獸醫學報，2000，22（3）：193－195.

［6］張秀根，樊生超，繆德年.一株新城疫病毒新強毒株（NL）的分離鑒定及 F 基因序列測定［J］.病毒學報，2000，16（4）：352－356.

［7］呂曉娟，龔建森，劉學賢，等.鵝副黏病毒分離株的生物學特性鑒定［J］.安徽農業大學學報，2008，35（4）：530－534.