沃尼妙林人工抗原的合成與鑒定

李偉嶺，岳永波，李金明，孔瑞崗，劉海亮

（河北遠征藥業(yè)有限公司 河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050041）

沃尼妙林（valnemulin，Val）是新一代截短側(cè)耳素（pleuromutilin）類半合成的動物專用抗生素，屬二萜烯類，與泰妙菌素屬同一類藥物，主要用于豬支原體肺炎、豬痢疾、豬結(jié)腸炎和豬回腸炎的治療［1－3］。現(xiàn)已上市的沃尼妙林原料藥為鹽酸沃尼妙林，其化學結(jié)構(gòu)式見圖1，化學名為［［2－［［（2R）－2－氨基－3－甲基－1－氧代丁基］氨基］－1，1－ 二甲基乙基］硫基］乙酸（3aS，4R，5S，6S，8R，9R，9aR，10R）－6－乙烯基十氫－5－羥基－4，6，9，10－四甲基－1－氧代－3a，9－丙 醇－3aH－環(huán)戊二烯并環(huán)辛烯－8－基酯鹽酸鹽，性狀為白色或淡黃色非結(jié)晶性粉末，具有吸濕性，在水、無水乙醇中易溶，在甲基叔丁基醚中幾乎不溶，熔點為174℃～177℃，比選度為15.5℃～18.0℃，pH 值為3.0～6.0［4－7］。

圖1 鹽酸沃尼妙林的化學結(jié)構(gòu)式

沃尼妙林的抗菌機理與泰妙菌素相似，能與病原微生物核糖體上的50S亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成［8］。沃尼妙林具有治療效果好、消除快、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，越來越受世界各國的關(guān)注。但動物試驗表明，其亦可引起一些不良反應［9］。此外，沃尼妙林可與鹽霉素、沙拉里菌素、馬杜霉素等相互作用，導致動物出現(xiàn)中毒癥狀，甚至死亡［10］。因此，其對人體的健康具有潛在危害，目前EMEA規(guī)定沃尼妙林在豬體內(nèi)的最大殘留限量為肝臟：500μg／kg、腎臟：100μg／kg、肌肉：50μg／kg［11］。目前，對沃尼妙林尚未有一種公開發(fā)表的穩(wěn)定、可靠的殘留檢測方法，可能是由于沃尼妙林的最大吸收在近紫外區(qū)，各種雜質(zhì)對其檢測影響較大，這無疑增大了其殘留檢測的難度。免疫化學分析以抗原抗體間的特異性結(jié)合為原理，可避開上述困難而獨具優(yōu)勢。免疫化學分析的主要影響因素是抗體的特異性和親和性，這取決于免疫抗原的分子結(jié)構(gòu)。因此，沃尼妙林人工抗原的合成與鑒定是產(chǎn)生特異性抗體以及建立沃尼妙林獸藥殘留分析方法的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

1 材料

1.1 材料與試劑 沃尼妙林為自制，HPLC經(jīng)面積歸一化法測其純度為98.7%；牛血清白蛋白（BSA），購自Sigma公司；低分子量蛋白質(zhì)標準，購自華美生物有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備 紅外分光光度計（NicoletGC／IR Interface Magna－IRTMspect rometer 550），蛋白層析儀（Pharmacia AKTA FPLC），紫外分光光度計（HP8452），水平電泳儀（Bio－Rad），凍干機（DF－3－550－MP），熒光光譜儀（F－2500，日本日立公司）。

2 方法

2.1 沃尼妙林人工抗原的合成 將15mg沃尼妙林、10mL 1mol／L鹽酸加至50mL三口瓶中，攪拌，冰水浴降溫。于0℃～5℃滴加預冷的1%亞硝酸鈉水溶液，直至碘化鉀－淀粉試紙變藍，避光、保溫反應30min，制得重氮鹽溶液。將300mg BSA、20mL硼砂－硼酸緩沖溶液（0.2mol／L，pH 值8.7）加至另一50mL三口瓶中，攪拌，冰水浴降溫。于4℃下滴加上述重氮鹽溶液，滴加過程中用5%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值約為8，滴加完畢保溫反應24h。然后，將反應液裝入預處理好的透析袋中，用蒸餾水透析3d，每天換液4次，真空冷凍干燥制得褐色絮狀人工抗原。此人工抗原記作Val－BSA，－20℃保存，備用。

2.2 沃尼妙林人工抗原的鑒定

2.2.1 IR鑒定 取1mg凍干的人工抗原與適量KBr混勻研細，壓片后，進行IR掃描。同法對BSA和Val分別進行IR掃描，對照三者的IR圖譜。

2.2.2 SDS－PAGE鑒定 取適量人工抗原、BSA及標準蛋白，分別溶于純化水中，在5%濃縮膠、12%分離膠中進行SDS－PAGE凝膠電泳分析。

2.2.3 UV鑒定 取適量凍干的人工抗原、沃尼妙林與BSA，分別溶于10mL甲醇／水溶液（V／V＝1∶1）中，分別進行UV掃描，對照三者的UV圖譜。

2.2.4 熒光光譜鑒定 分別取沃尼妙林、牛血清白蛋白及人工抗原適量，加50%甲醇水溶液配制成適宜濃度的試液，將各試液分別置于1cm石英比色池中，設(shè)置空白溶劑為50%甲醇水溶液，激發(fā)波長為278nm，激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫寬度均為5nm，掃描速度為240nm／min，掃描范圍為320～500 nm，進行熒光發(fā)射光譜掃描。

3 結(jié)果與討論

3.1 IR鑒定結(jié)果 如圖2所示，BSA與Val－BSA的IR圖譜區(qū)別很小，很難判斷沃尼妙林是否與載體蛋白BSA偶聯(lián)形成人工抗原。

圖2 紅外光譜鑒定Val－BSA

理論上，利用IR鑒定人工抗原是否合成是可行的，但是一些半抗原藥物分子相對于大分子量的載體蛋白因分子量較小，其結(jié)構(gòu)信息被掩埋在載體蛋白的結(jié)構(gòu)信息中，從而難于辨別人工抗原是否合成成功。

3.2 SDS－PAGE鑒定結(jié)果 如圖3所示，偶聯(lián)物Val－BSA與BSA的電泳圖稍有差別，但區(qū)別并不明顯。

吳定［12］利用SDS－PAGE凝膠電泳確定了磺胺甲基嘧啶－BSA人工抗原的成功合成。SDS－PAGE凝膠電泳的遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子量，與蛋白質(zhì)所帶電荷和形狀無關(guān)。因此，在一定條件下蛋白質(zhì)的分子量與電泳的遷移率之間存在相應的關(guān)系，可以通過蛋白質(zhì)遷移率的差異判定蛋白質(zhì)的分子量。利用SDS－PAGE凝膠電泳鑒定人工抗原時，是否可以通過提高電泳膠的長度和適量提高膠的濃度來提高電泳的分辨率還有待進一步研究。

圖3 SDS－PAGE鑒定 Val－BSA

3.3 UV鑒定 如圖4所示，沃尼妙林在218nm處有特征吸收峰，BSA在228nm和278nm處有兩個特征吸收峰，而沃尼妙林人工抗原Val－BSA也存在兩個特征吸收峰，分別位于228nm和266nm處，它保留了BSA在228nm處的紫外特征吸收峰，但由于沃尼妙林的氨基與BSA發(fā)生了偶聯(lián)反應，所以人工抗原Val－BSA的紫外峰形發(fā)生了改變，說明沃尼妙林半抗原與載體蛋白BSA已經(jīng)偶聯(lián)，沃尼妙林人工抗原合成成功。

3.4 熒光光譜鑒定 在人工抗原的制備過程中，半抗原以特定的基團（如氨基－NH2、羧基－COOH等）通過相應的反應連接到載體蛋白BSA上。BSA上色氨酸、酪氨酸、組氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光。本文中，通過重氮化偶聯(lián)法使沃尼妙林與BSA上的色氨基酸、酪氨基酸、組氨酸等殘基偶聯(lián)，由于BSA產(chǎn)生熒光主要是這些氨基酸的貢獻，一旦有其他基團連接上后必然改變其熒光光譜特性。圖5是沃尼妙林人工抗原的熒光光譜圖，從圖中可看出，沃尼妙林人工抗原的最大發(fā)射波長與牛血清白蛋白BSA相比發(fā)生了明顯位移，表明沃尼妙林人工抗原已經(jīng)成功合成。

綜上所述，本文根據(jù)沃尼妙林的分子結(jié)構(gòu)特點，采用重氮化法成功合成其人工抗原；對照4種鑒定方法，發(fā)現(xiàn)紫外光譜法和熒光光譜法是沃尼妙林人工抗原的有效鑒定方法，為下一步的沃尼妙林免疫化學分析方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

圖4 沃尼妙林人工抗原的紫外圖譜

圖5 沃尼妙林人工抗原的熒光光譜圖

［1］Bemer H，Vypiei H.Pleuromutilin derivatives and their use［P］.EP：0153277，1985.

［2］European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia（5.4）［M］.5th ed.Ottawa，Canada：Renouf Publishing Company Ltd，2007：4043－4044.

［3］Hirokama Y，Kinoshita H，Tanaka T，etal.Water－soluble pleurotilin derivative with excellet in vitro and in vivo antibacterial activity against Gram－positive pathogens［J］.Med Chem，2008，51（7）：1991－1994.

［4］Springer D M，Sorenson M E，Huang S，etal.Synthesis and activity of a C－8keto pleurotilin derivative［J］.Bioorg Med Chem Lett，2003，13（10）：1751－1753.

［5］吳汝林，王倩茹.鹽酸沃尼妙林的工藝研究［J］.現(xiàn)代化工，2009，29（12）：60－61.

［6］馮德鑫，李新樂，潘強，等.鹽酸沃尼妙林的合成［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2010，41（4）：244－246.

［7］Koller K，Schwarz F.Formulation of valnemulin［P］.US：6284792，2001－09－04.

［8］Poulsen S，Karlsson M，Johansson L，etal.The Pleuromutilin Drugs Tiamulin and Valnemulin Bind to the RNA at the Peptidyl Transferase Centre on the Ribosome［J］.Mol Microbiol，2004，41（5）：1091－1099.

［9］EMEA.Econor，INN －Valnemulin［DB／OL］.http：／／www.emea.europa.eu／vetdocs／PDFs／EPAR／econor／003199en6.pdf，2004.

［10］Stipkovits L，Ripley P H，Tenk M.The efficacy of valnemulin（Econor）in the control of disease caused by experimental infection of calves with Mycoplasma bovis［J］.Research in veterinary Science，2005，78：207－215.

［11］EMEA.Committee for veterinary medicinal products（valnemulin）summary report［DB／OL］.http：／／www.emea.europa.eu／pdfs／vet／mrls／033998en.pdf，1998.

［12］吳定，張羽航，姚汝華.ELISA測定乳中磺胺甲基嘧啶殘留［J］.中國獸醫(yī)學報，1999，19（2）：175－177.