EGF誘導肝癌細胞系HepG2增殖及其作用機制

陳少卿，汪小浪

（南昌大學第一附屬醫院腫瘤科，南昌 330006）

原發性肝癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，嚴重威脅人民群眾的生命及健康，全世界每年新發肝癌患者約60多萬，居惡性腫瘤的第5位，東亞及環太平洋地區是肝癌高發地區，我國新發肝癌人數占全球人數一半以上；我國發病率高的原因在于我國乙肝患病人數多，丙型肝炎的發病率近年亦有明顯的上升趨勢，肝癌多在乙肝、丙肝等慢性肝炎后肝硬化的基礎上產生；肝癌的治療手段主要是手術切除、介入治療、靶向治療及中醫治療等方法，但由于原發性肝癌治療的敏感性差，且大部分患者就診時已經晚期，因此，預后非常差，1995年衛生部統計，我國肝癌年死亡率已達20.4/10萬人，僅次于胃癌，居第2位[1-3]。因此，揭示肝癌細胞的發生、發展以及侵襲轉移過程中異常信號的轉導機制,可以為肝癌的臨床治療提供新的思路和理論依據。

表皮生長因子（EGF）是生長因子家族的主要成員之一，屬于胞外信息物質，其作用方式是通過與靶細胞上特異性表皮生長因子受體（EGFR）結合，從而誘導受體自身磷酸化，活化的EGFR可激活眾多的下游信號途徑，從而產生相應的生物學效應[4]。EGFR又稱C-erbB受體，基因位于7q11.13，具有酪氨酸蛋白激酶活性。EGFR結構可分為胞外區、跨膜區和胞內區3個部分[5]，胞外區與配體結合而被激活，通過胞內側激酶反應將胞外信號傳至胞內，經下游信號傳導途徑影響細胞的增殖分化。本研究通過觀察EGF對肝癌細胞系HepG2增殖的影響，初步探討C-erbB2在其中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2（上海鑫閔生物科技有限公司），EGF（Sigma），Trizol（Takara），Taq 酶（Promega），DEPC（博大泰克產品），Marker（Promega），OligdT（Promega），MMLV 逆轉（Promega）。β-Actin 引物序列:上游 5’-GTGGGCCGCTCTAGGCA-3’，下游 5’-CTCTTT-GATGTCAGCACGA-3’，擴增片段長度243 bp（上海生物工程中心合成）；C-erbB2引物序列：上游 5’-AGCTGCACTGTGGATGTCAG-3’，下游 5’-GAGCCTTCGGCACTGTCTAC-3’，擴增片段長度201 bp（上海生物工程中心合成）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

細胞常規培養在含10%小牛血清的DMEM培養液中。取對數生長的肝癌細胞，胰酶消化接種后，在無血清DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2的孵箱培養8 h，需藥物處理的4組分別加入EGF至終濃度分別為 0.1、1、10、100 μg·L-1，對照組不加藥，繼續培養6 h。

1.2.2 MTT增殖指數

按每孔2×105個細胞接種于24孔板,分別以不同濃度的EGF加入DMEM培養基，培養48 h，加入5 g·L-1的MTT溶液20μL，繼續培養2 h。棄上清，加入DMS0 200μL，搖晃 5 min，取 150μL加入 96孔板中。在酶標儀波長492 nm處測A值。設4個復孔。根據MTT結果、酶標法觀測肝癌細胞株吸光度值。

1.2.3 RT-PCR檢測

1）總RNA的提取：將培養的1×107肝癌細胞分為對照組、EGF組。加入0.5mL Trizol，劇烈震蕩后加 0.1 mL氯仿，劇烈搖晃 15 s，以 10 000 g，4℃離心20min。轉移水相，加預冷的異丙醇，放置10min，10 000 g，4℃離心20min，離心后在管底見RNA膠片狀沉淀。經75%的乙醇洗脫后，RNA沉淀物在室溫下自然干燥，用0.1%的DEPC水15μL溶解后56℃水浴10min。

2）逆轉錄：提取的總 RNA 加入 3 μL Olig（dT），70℃孵育5min后置于冰上5min。依次加M-MLV逆轉錄酶 1μL、M-MLV Buffer 5 μL、Rnase inhibitor 1μL、Dntp 1.5μL，DEPC水加至 25μL，37℃水浴 60 min，合成 c-DNA。

3）PCR：反應體系為 c-DNA 5 μL、上下游引物（目的引物和 β-Actin）各 1 μL、dNTP 1.5 μL、10×Buffer 5 μL、25 mmol MgCl21 μL、Taq 酶 0.5 μL，加DEPC水至50μL。簡單離心后上覆石蠟油50μL。94℃預變性 5min后，PCR 程序為：94℃ 60 s，56℃55 s，72℃60 s，35個循環。最后一個循環延伸5min結束。

4）瓊脂糖凝膠電泳：將PCR擴增產物和Marker在2%的瓊脂糖凝膠中電泳30min（電壓為100 V），最后在自動凝膠成像系統下觀察、照相并分析。

1.3 判斷標準

利用自動凝膠成像系統，C-erbB2 mRNA的表達水平用相對量表示，即C-erbB2 mRNA條帶密度掃描數值除以本組內對照β-Actin的掃描數值求得一個相對比值。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 EGF對肝癌細胞系HepG2增殖作用的影響

10μg·L-1EGF組的吸光度 A值比對照組高22.2%（P<0.05），比 0.1 μg·L-1EGF 組高 20.5%（P<0.05），比 1 μg·L-1EGF 組高 13.0%（P<0.05），和 100 μg·L-1EGF組的吸光度A值相比差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。結果提示，EGF可促進肝癌細胞系HepG2的增殖，并與其劑量有關。

圖1 各組吸光度A值比較

2.2 C-erbB2 m RNA在EGF誘導肝癌細胞系HepG2增殖中的表達變化

選取10μg·L-1為EGF的最佳作用濃度，將細胞株分成2組，分別為對照組和EGF組。利用RTPCR技術測定各組C-erbB2mRNA的表達情況。結果顯示在Marker為297、210 bp的電泳條帶之間，可見擴增片段長度為243 bp的β-actin的電泳條帶。在210 bp的Marker電泳條帶附近，對照組、EGF組均可見擴增長度為201 bp的電泳條帶。而且EGF組的條帶明顯亮于對照組 （圖2）。分別用各組C-erbB2 mRNA條帶光密度值除以本組內對照β-Actin的光密度值發現，EGF組、對照組的比值分別為1.14、0.39（圖 3），與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。提示，EGF可以增強C-erbB2mRNA的表達。

圖2 2組C-erbB2mRNA的表達

圖3 2組C-erbB2mRNA光密度比值分析

3 討論

EGF是Cohen于1962年首次從成年雄鼠的頜下腺分離提純的一種單鏈多肽[6]。它是一種強有力的細胞分裂促進因子，能促進體內多種細胞的分裂和增殖。一般認為其作用于細胞膜EGFR，激活氨酸蛋白激酶，在細胞內信使三磷酸肌醇（IP3）或Ca2+等的參與下，作用于與細胞生長、增殖有關的蛋白質或因子，從而調控細胞核內基因的轉錄。EGFR家族由4個成員C-erbB1、C-erbB2、C-erbB3及 C-erbB4組成，是受體型的酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine protein kinase，RPTK）。EGF對人正常肝細胞的增殖有明顯的作用，其主要是通過調節EGFR的數量和代謝等環節刺激DNA的合成，從而刺激肝細胞的增殖[7]。但對肝癌細胞的作用目前研究尚不一致。有人認為EGF對癌細胞的生長起促進作用，它可以使正常細胞惡變[6]，在卵巢癌及乳腺癌中，C-erbB2 的高表達，并與腫瘤的惡性程度和預后相關[8-9]。但也有人認為EGF對腫瘤的生長起抑制作用，體外撤去長期作用的EGF，可使正常的細胞惡變，說明EGF可維持細胞的正常性狀[10]。可見，EGF對肝癌細胞的作用尚不明確，其中的作用機理亦未明了。

本文研究發現，EGF能呈劑量依賴方式誘導肝癌細胞系HepG2的增殖，和戚之琳等[11]報道的一致，10μg·L-1EGF可顯著增強肝癌細胞系HepG2 C-erbB2mRNA的表達，其機制可能與上調原癌基因C-erbB2的表達有關。曲嫻等[12-13]報道EGF與其受體結合后，能刺激腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞轉移。所以EGFR信號途徑與腫瘤增殖、轉移、化療耐藥和抗凋亡作用之間存在著一定的聯系。分析原因，可能是C-erbB2胞外段結合EGF后，引發變構形成二聚體，激活RPTK，引起胞內段酪氨酸自身磷酸化。后者催化多種底物酪氨酸殘基磷酸化，從而啟動、催化與肝癌細胞生長、增殖有關的生化過程[14]。戚之琳等[11]在實驗中觀察到EGF能夠促進肝癌細胞的增殖和體外遷移能力,而MAPK信號通路抑制劑PD98059對肝癌細胞的增殖和遷移能力則具有抑制作用，RT-PCR結果表明EGF促進細胞增殖的機制可能是上調了肝癌細胞中Survivin基因的表達水平。戚之琳等[11]認為EGF還可能通過MAPK信號通路促進肝癌細胞的增殖及遷移侵襲，Survivin基因表達的改變可能是通過MAPK信號轉導途徑而實現的，EGF/MAPK信號通路可以作為肝癌細胞增殖和轉移的治療靶點，為臨床肝癌的治療提供了新的思路。然而，EGF調控肝癌細胞株增殖的其他信號通路有待于進一步研究。

[1]周寧新.肝膽胰脾外科實踐[M].北京：科學技術出版社,2005:71-78.

[2]張啟,錢禮.腹部外科學[M].北京：人民衛生出版社,2006:556-557.

[3]夏穗生.現代腹部外科學[M].2版.武漢：湖北科學技術出版社，2007:424.

[4]樂志培.表皮生長因子受體功能與轉化蛋白的關系[J].生物化學通訊,1989,2（1）:9-12.

[5]Jorissen R N,Walker F,Pouldt N,et al.Epidermal growth factor receptor mechanisms of activation and signaling[J].Exp Cell Res,2003,284（1）:31-53.

[6]Murata H，Kawano S，Tsuji S，et al.Cyclooxygenase-2 overexpression enhances lymphatic invasion and metastasis in human gastric carcinoma [J].Am JGastRoenterol，1999，94（2）：451-455.

[7]Ohno R,Yoshinaga K,Fujita T,etal.Depth of invasion parallels increased Cyclooxygenase-2 level in patients with gastric carcinoma[J].Cancer，2001，91（10）:1876-1881.

[8]魯艷明，王亞軍.EGFR和C-erbB2蛋白在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達及其臨床意義[J].中國醫科大學學報，2004,33（2）:147-150.

[9]Tsujii M,Dubois R N.Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase [J] Cell,1995,83（2）:493-501.

[10]Maeda K,Kang S M,Onoda N,et al.Epidemal growth factor expression in preoperative biopsy specimens correlates with disease recurrence in patients with early gastric carcinoma [J].Cancer,1999,86（4）:566-571.

[11]戚之琳，畢富勇.EGF調控HepG2細胞增殖和遷移的分子機制[J].皖南醫學院學報，2009,28（4）:248-250.

[12]曲嫻,陳杰.表皮生長因子受體反義寡核苷酸抑制人結腸癌細胞的增值[J].世界華人消化雜志,2006,14（35）:3414-3416.

[13]張曉晶，王更生，劉云鵬.EGFR信號通路調控結腸癌Caco2細胞侵襲轉移的分子機制[J].第三軍醫大學學報，2006，28（14）:1479-1482.

[14]Wiley L M，Adamson E D.Epidermal growth factor receptor function in early mammaliam development[J].Biol Essays，1995，17（10）:839-846.