固相萃取柱高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方甘草含片中嗎啡的含量

熊水蓮，侯 莉

（1.江西制藥有限責(zé)任公司質(zhì)量檢驗(yàn)部，南昌330052；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，南昌330006）

復(fù)方甘草含片是臨床上常用的祛痰鎮(zhèn)咳復(fù)方制劑，主要成分有甘草浸膏、阿片粉、樟腦和八角香油，其中阿片在復(fù)方甘草含片中的劑量遠(yuǎn)小于阿片鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的常用劑量。阿片所含的主要是生物堿嗎啡。本文通過(guò)建立固相萃取柱高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定復(fù)方甘草含片中嗎啡含量的方法，旨在控制復(fù)方甘草含片中嗎啡的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

北京賽多利斯BT25S電子天平（十萬(wàn)分之一）；日本島津LC-10AvT紫外檢測(cè)器；日本島津LC-10AT VP泵；千譜工作色譜工作站。

1.2 試藥

復(fù)方甘草含片（江西制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：1201121、1201131、1111251）；嗎啡對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：171201-200521；含量：100%），乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，庚烷磺酸鈉為分析純，醋酸為分析純，氨試液（按藥典方法配制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Alltima C8 150mm×4.6mm，流動(dòng)相為0.002 5mol·L-1庚烷磺酸鈉水溶液-0.05mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈（5∶5∶2），流速：1.0 mL·min-1，柱溫：室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量20 uL。理論板數(shù)按嗎啡峰計(jì)算不低于1 000，嗎啡峰與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合要求。

固相萃取柱系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以供試品溶液的制備中相同的處理?xiàng)l件和洗脫條件試驗(yàn)，精密量取濃度為每1mL中含嗎啡對(duì)照品0.1 mg的5%醋酸溶液0.5 mL，置處理好的固相萃取柱上，同法洗脫，用5 mL量瓶收集洗脫液至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液和含量測(cè)定項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各10 uL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按下列公式計(jì)算，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液結(jié)果應(yīng)在 0.97～1.03 之間[1]。

式中Ax為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液?jiǎn)岱确迕娣e；Ar為對(duì)照品溶液?jiǎn)岱确迕娣e；Cx為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液濃度；Cr為對(duì)照品溶液濃度。

2.2 溶液的制備

1）對(duì)照品溶液制備：取嗎啡對(duì)照品約25 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加含2%甲醇、5%醋酸的溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品貯備液，備用。精密量取2mL對(duì)照品貯備液置50mL，加含2%甲醇、5%醋酸的溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2）供試品溶液制備：取復(fù)方甘草含片粉末10片稱重，精密稱定，置磨口錐形瓶中，精密加水90mL，超聲處理5min，精密加稀鹽酸10mL，搖勻，超聲處理20 min使嗎啡溶解，取出，放冷，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液1mL，置固相萃取柱[取固相萃取柱1支，依次用甲醇-水（3∶1）15 mL 與水 5mL 沖洗，再用氨水溶液（pH值為9）沖洗至流出液pH值為9，滴加氨試液適量，使萃取柱內(nèi)溶液的pH值為9（上柱前另取同體積的續(xù)濾液預(yù)先調(diào)試，以確定滴加氨試液的量），搖勻，待溶劑滴盡后，用水約20mL沖洗，用含2%甲醇、5%醋酸的溶液洗脫，用5 mL量瓶收集洗脫液至刻度，搖勻，即得。

2.3 測(cè)定方法

精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 uL，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

取對(duì)照品貯備液，置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋，制得濃度分別為 5﹑10 ﹑15 ﹑20﹑30 μg·mL-1;進(jìn)樣20 uL測(cè)定，以對(duì)照品濃度對(duì)峰面積積分值進(jìn)行線性回歸。結(jié)果得回歸方程：A=1.42×105C-0.459 5，r=1，顯示嗎啡在5~30μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取復(fù)方甘草含片的供試品溶液 20μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。測(cè)得主峰面積分別為993784、994359、995021、993951、994209，平均值為994265，計(jì)算RSD為0.1%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的復(fù)方甘草含片按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件分別進(jìn)樣重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均含量為 0.39 mg·片-1，RSD為0.9%，說(shuō)明重復(fù)性良好，

2.7 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液 1 份，分別于 0﹑2﹑4﹑6﹑8 h 分別進(jìn)樣20μL測(cè)定，嗎啡峰面積基本不變，RSD為0.9%。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱量復(fù)方甘草含片粉末約0.54 g共5份，每份分別準(zhǔn)確加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)所述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱量各批號(hào)復(fù)方甘草含片約5.44 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)所述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算其含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該3批復(fù)方甘草含片中嗎啡的含量均符合規(guī)定（0.36~0.44mg·片-1[2]）。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本方法中選用庚烷磺酸鈉試劑，由于其是離子對(duì)試劑，離子對(duì)試劑用于高壓液相萃取液相色譜中能改善峰形，分析結(jié)果重現(xiàn)性好；選用乙腈作為有機(jī)相是由于乙腈對(duì)柱子的損耗小，洗脫能力比甲醇強(qiáng),而且不易出現(xiàn)鬼峰。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

由于甲醇的截止峰的波長(zhǎng)是190 nm，而乙腈的截止波長(zhǎng)是210 nm，所以選擇波長(zhǎng)為220 nm。

3.3 進(jìn)樣量的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用的儀器是手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，由于此儀器的最低定量環(huán)進(jìn)樣量為20μL，若使用微量進(jìn)樣器進(jìn)10μL，易產(chǎn)生氣泡且人為因素易產(chǎn)生誤差，而采用20μL定量環(huán)進(jìn)樣，具有量樣精密、快速、便捷等特點(diǎn)。所以本文采用20μL定樣環(huán)進(jìn)樣。

3.4 色譜柱的選擇

C18出峰時(shí)間慢，能達(dá)到很好的效果；C8出峰時(shí)間快，能節(jié)約時(shí)間，在本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得是嗎啡的含量，只要能達(dá)到分離的效果即可。故選用C8作為色譜柱。

用固相萃取方法處理復(fù)方甘草含片，簡(jiǎn)便、快速，樣品處理時(shí)間短。由于樣品中嗎啡的含量極少，若分離提取和洗滌次數(shù)較多，嗎啡含量會(huì)損失，嗎啡在堿性中也容易流失，中國(guó)藥典[2]中檢測(cè)的方法流程過(guò)于復(fù)雜、繁鎖，提取的結(jié)果誤差比較大，而采用本法測(cè)定含量更準(zhǔn)確可靠，操作起來(lái)簡(jiǎn)捷，可用于復(fù)方甘草含片生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

[1]曾勇固.固相萃取技術(shù)-HPLC測(cè)定復(fù)方甘草片中嗎啡的含量[J].色譜，1998，16（3）：291.

[2] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典 （二部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：574.