Ang-1和Ang-2在肝細胞癌組織中的表達及其與血管生成的關系

韓 斌，龐志剛，劉 超，陳文超，陸 旭，王廣田

(鄭州大學第二附屬醫院普外科，河南鄭州450014)

肝細胞癌(HCC)是典型的多血供、高惡性、易轉移的惡性腫瘤，血管生成是其發生發展和轉移的必要環節，多種血管生成因子參與其腫瘤血管生成調節［1］。近年來發現血管生成素(Ang)及其受體與多種腫瘤血管生成有關［2－3］，但其與 HCC的關系鮮有報道。本研究采用免疫組化法檢測36例肝細胞癌組織中Ang-1和Ang-2的表達，并以CD34標記檢測HCC組織的微血管密度(MVD)，探討Ang與HCC病理特征和血管生成的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2004年至2006年我院手術切除并經病理證實的HCC存檔蠟塊標本36例，其中30例帶有癌旁組織，所有入組病例臨床資料均完整。男性30例，女性6例，年齡30～67歲，平均年齡48.8歲。臨床病理特征:AFP陽性28例，AFP陰性8例;HBsAg陽性30例，HBsAg陰性6例;腫瘤直徑≥5 cm 17例，＜5 cm 19例;Edmondson病理分級，Ⅰ級7例，Ⅱ級13例，Ⅲ級8例，Ⅳ級8例;鏡下血管侵犯24例，無血管侵犯12例。結合影像學資料及手術所見，門脈主干有癌栓、肝門部淋巴結轉移、同一肝葉主癌灶周圍瘤數目≥2個或有多個衛星結節判定為高侵襲轉移，共14例;余為低侵襲轉移，共22例。5例外傷性肝破裂切除肝組織標本為健康對照，均為男性，年齡18～45歲，均無乙肝病史，HBsAg陰性。

1.2 主要試劑 兔抗人Ang-1單克隆抗體、兔抗人Ang-2單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司，所有試劑均為濃縮型，工作濃度1∶100。

1.3 檢測方法及結果判定標準 嚴格按照試劑盒說明書進行染色，以PBS替代一抗作陰性對照。Ang-1和Ang-2結果判斷:細胞胞漿內和(或)胞膜出現棕黃色顆粒為陽性細胞，結果評分參照文獻［4］:染色強度分級，細胞基本無著色為0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分;染色范圍分級，陽性細胞比率0% ～5%為0分、6% ～25%為1分、26% ～50%為2分、50%以上為3分;將每張切片2項得分相乘，≥4分為陽性，＜4分為陰性。MVD的判定:先用100倍光鏡掃視整個切片，尋找高血管密度區，再在3個400倍視野下計數CD34陽性細胞，取其平均值為結果。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0進行數據處理，計數資料比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法，計量資料比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Ang-1和Ang-2的表達 5例正常肝組織標本中，Ang-1陽性者3例，Ang-2均為陰性。HCC組織及癌旁組織中Ang-1和Ang-2均有不同程度的表達，陽性細胞主要是腫瘤細胞，癌旁部分肝細胞也有陽性表達，均為胞漿著色，其中Ang-2的陽性表達情況見圖1。Ang-1在HCC組織和癌旁組織中的陽性率分別為44.44%(16/36)和 53.33%(16/30)，差異無統計學意義(χ2=0.518，P ＞0.05);HCC 組織與正常肝組織中Ang-1的表達差異亦無統計學意義(χ2=0.427，P＞0.05)。Ang-2在HCC組織和癌旁組織中的陽性率分別為 83.33%(30/36)和 33.33%(10/30)，差異有統計學意義(χ2=17.135，P ＜0.05)。

2.2 MVD的檢測結果 36例HCC組織的平均MVD為22.56 ±9.38，Ang-1 陽性者為 21.08 ±11.26，陰性者為23.24 ±8.02，差異無統計學意義(t=0.754，P ＞0.05);Ang-2 陽性者為 28.48 ± 10.36，陰性者為14.22 ±11.02，差異有統計學意義(t=4.359，P ＜0.01)。HCC組織中MVD情況見圖2。

2.3 Ang-1和Ang-2與HCC不同臨床病理特征的關系 Ang-2表達與血管侵犯、侵襲轉移程度有關(P＜0.05)，而與其他臨床病理學特征無關(P＞0.05)。Ang-1表達與各臨床病理學特征無關(P＞0.05)。見表1。

3 討論

Ang是由血管內皮分泌的血管源性生長因子，是酪胺酸激酶受體Tie-2的配體，Ang家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4共4個成員，其中Ang-1和Ang-2是最有效的血管新生調節因子。Ang-1廣泛表達于胚胎和成人，在人體內，Ang-1主要作用是通過促進內皮細胞與周圍細胞的黏附從而促進并維護已形成血管的完整性。Ang-2在人類和小鼠體內，選擇性表達于卵巢、子宮和胎盤，主要作用是降低細胞與基質和細胞與細胞之間的聯系，同時Ang-2通過與Ang-1競爭性結合Tie-2從而阻斷Ang-1的作用［5］。

本研究發現HCC組織過表達Ang-2，其陽性率明顯高于癌旁組織，正常肝組織則無表達，且Ang-2表達陽性者MVD明顯升高，由此推測Ang-2與HCC腫瘤血管生成有關。而Ang-1在正常肝組織、HCC組織、癌旁組織中均有陽性表達，陽性率差異無統計學意義，Ang-1表達陽性者腫瘤MVD無明顯升高，說明Ang-1可能是正常存在的血管生成因子，與新生血管的穩定和成熟有關，與HCC腫瘤血管生成無關。有研究［6］認為過表達的Ang-2誘導血管退化發生，當血管內皮細胞生長因子(VEGF)水平較高時，Ang-2競爭抑制Ang-1效應，血管結構松解，基底膜和周圍細胞對血管形成的限制減弱，內皮細胞對VEGF的敏感性增加，并導致新的毛細血管形成，腫瘤血管壁保持稀薄而有較高的滲漏性的特點，使腫瘤細胞得以實現轉移。本研究發現Ang-2與腫瘤血管侵犯、侵襲轉移程度有關，也支持這一觀點。

有研究［7］發現Ang-2與HCC的腫瘤大小、病理分級等有關，本研究未能得出類似結論，這可能與樣本量及研究方法不同有關。另外腫瘤血管生成又是一個復雜的生理過程，血管生成因子在其中起不同的作用，組織微環境也有不同的影響，缺氧等微環境可調節各種血管生長因子的分泌［8］。HCC組織中可能存在Ang-2與Ang-1比例的失調、Ang-2與VEGF的協同作用，尚需進一步研究闡明。

綜上所述，作者認為HCC組織中Ang-2高表達，且與腫瘤血管生成有關，檢測Ang-2有助于判斷腫瘤侵襲轉移能力，但不能反映惡性程度。

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