脂肪間充質干細胞與HGF在胃潰瘍治療中的作用

陳志鋒 黃聰武

·綜述·

脂肪間充質干細胞與HGF在胃潰瘍治療中的作用

陳志鋒 黃聰武

消化性潰瘍(peptic ulcer，PU)是全球性常見病，其高復發率仍是當前PU治療中的一大難題。而脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cell，ADSC)具有多向分化能力，以及分泌肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等生長因子的特性。因此，利用ADSC移植治療胃潰瘍，或可增強胃潰瘍患者的胃黏膜屏障，有望成為一種新穎的治療手段。本文就PU的治療現狀、ADSC和HGF的生物學特性、ADSC和HGF的相關研究進展作一綜述。

脂肪間充質干細胞;肝細胞生長因子;胃潰瘍;移植;基因轉染

消化性潰瘍(peptic ulcer，PU)主要指發生在胃和十二指腸的慢性潰瘍，即胃潰瘍(gastric ulcer，GU)和十二指腸潰瘍(duodenal ulcer，DU)，是一種臨床上常見的慢性胃腸道疾病。由于抑制胃酸藥物、保護胃黏膜藥物、根除幽門螺桿菌藥物的使用，PU發病率已呈下降趨勢，有效治愈率明顯提高，但如何降低PU的復發率，仍是當前PU治療中的一大難題。近幾十年來，隨著成體間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的發現，以及其具有的多向分化能力，讓人們看到了利用MSC分化為胃黏膜上皮細胞以改善胃黏膜防御-修復屏障和炎癥反應，從而治療GU并防止其復發的可能性。脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cell，ADSC)作為其中一種MSC，具有細胞數量大、取材創傷性小、可向胃黏膜上皮細胞分化、無免疫排斥反應等優點。利用ADSC移植治療GU，有可能會成為一種新穎的治療手段。本文現對PU的治療現狀、ADSC和HGF的生物學特性、ADSC和HGF相關的研究進展作一綜述。

1 消化性潰瘍的治療現狀

自從1910年Schwartz提出了“無酸無潰瘍”的觀點后，胃酸就一直是在探討消化性潰瘍發病機制和治療措施時需要考慮的重點因素。H2受體拮抗劑(H2-Receptor Antagonist，H2RA)和質子泵抑制劑(Proton Pump Inhibitor，PPI)的廣泛應用及明顯療效也進一步確證了胃酸在潰瘍形成過程中的重要作用。而自從1982年幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，HP)被發現并證明其與PU的發生有密切關系，更是消化性潰瘍治療的一個里程碑。由于根除HP的意識的建立，以及PPI或膠體鉍為基礎加上抗HP感染藥物的聯合療法的出現，PU的治愈率達到了一個新的高度。但是PU的高復發率，至今仍是困擾著臨床醫師的一大難題。

PU的復發與多種因素有關:①在抑酸治療過程中驟然停藥會出現反跳性分泌從而導致潰瘍復發。②HP耐藥菌株的出現，使得傳統的抗HP治療方案的HP根除率有所下降;而HP的高再感染率，亦使更多的患者HP根治失敗。③非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)的持續應用，吸煙、酗酒、高鹽飲食等不良生活方式，工作、精神壓力增加所帶來的情緒應激，均可削弱胃黏膜的防御-修復功能，致使胃黏膜屏障受損并影響潰瘍愈合。因此潰瘍患者尤其是GU患者一旦合并上述危險因素，復發率也就會相應增加。

除了改進抗HP治療方案以提高HP根除率外，許多學者亦致力于尋求新的治療方式來治療PU并防止其復發。目前通過提高潰瘍愈合質量(quality of ulcer healing，QOUH)來防止PU復發的觀點正日益受到重視，也出現了眾多以提高潰瘍愈合質量為目的的治療思路和方法，如應用胃黏膜保護劑保護黏膜屏障、改善黏膜局部血液循環、利用細胞生長因子修復損傷黏膜等。而自從MSC被發現以來，其具有的多向分化潛能就一直受到研究人員的關注，并被廣泛應用在組織工程學、細胞治療和基因治療等方面。通過移植MSC來修復損傷的胃黏膜上皮組織，或可恢復黏膜原有的防御屏障功能并提高潰瘍愈合質量，從而達到治療GU并防止其復發的目的。既往國外有研究采用骨髓間充質干細胞(bone marrow derived stem cell，BDSC)治療GU并取得了令人鼓舞的結果，證實了BDSC與胃黏膜的再生密切相關，通過移植BDSC可加速潰瘍的愈合［1］。然而，由于BDSC的數量很少，并且獲取骨髓組織時創傷性大，這使得BDSC的臨床應用前景受到了限制。因此，有學者一直致力于尋求具有良好臨床應用前景、能用于組織工程或細胞治療的新的干細胞來源。脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cell，ADSC)同樣作為具有多向分化潛能的細胞，相比較BDSC而言有著提取方法簡單、細胞數量大、取材創傷性小等優點，因而在組織重建與修復、細胞治療等多方向的研究中顯示出廣泛的應用前景和極高的科研價值。

2 ADSC的生物學特性

ADSC可從脂肪抽吸物、腹股溝脂肪墊或髕骨下脂肪墊中分離得到。一次脂肪抽吸術約可吸取200 ml脂肪抽吸物，其中可產生約1×106個ADSC，而局部麻醉下行骨髓穿刺術一般最多只能抽出約40 ml骨髓，其中包括約2.4×104個MSC，即通過分離脂肪獲得的間充質干細胞的量是骨髓分離獲得量的40倍。由此可見，與其他來源的間充質干細胞比較，ADSC具有可大量獲取、提取方法簡單且對供區損傷不大的獨特優勢。

ADSC在加有任何批號胎牛血清的培養基中均能很好的擴增，這點不同于BDSC對培養基中胎牛血清的來源和質量有嚴格要求。在傳代培養中，平均倍增時間為60 h且能保持穩定的倍增率直至13～15代，其中衰老和死亡細胞的所占比例也很少。這說明ADSC的體外擴增能力很強，通過傳代培養可獲得大量有分化能力的細胞。

ADSC和BDSC無論是形態學上的外形抑或是所表達的細胞表面標志物均很相似;CD105、Stro-1、CD166是確定細胞多向分化能力的常見細胞表面標志物，在ADSC和BDSC中均有表達［2，3］。ADSC和BDSC還表達CD29(主要在血管形成方面發揮作用)和CD44(在細胞外基質形成方面發揮作用)。ADSC和BDSC均不表達CD31、CD34、CD45，提示其可能沒有造血干細胞特性［4］。只有不到1%的ADSC表達HLADR，大部分表達MHC I型分子，提示ADSC具有免疫逃逸特性，可以進行異體移植［5］。

由于ADSC和MSC具有無論在形態上還是在細胞表面標志物上都具有大量的相似性，且目前尚未發現ADSC的特異性細胞表面標志物，ADSC曾一度被懷疑僅僅是位于脂肪組織中的MSC家族，有可能是血液中的MSC通過周圍血管組織向脂肪組織的滲透。也有觀點認為ADSC可能由多種異源性細胞構成，包括內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞及前體脂肪細胞等。但通過免疫熒光和流式細胞儀檢測可以發現兩者間的區別:ADSC表達CD49 d，不表達CD106;MSC則相反［6］。目前認為造成這種區別的原因可能與細胞存在的微環境和細胞的具體功能有關，如CD106在MSC和造血干細胞(haemopoietic stem cell，HSC)相互作用中(即HSC的歸巢和動員過程中)起重要作用，而ADSC不表達CD106則與其處于非造血組織的特點相一致。這證實了脂肪組織中存在的ADSC不同于在骨髓中發現的MSC。而間充質干細胞與成體細胞最大的區別在于間充質干細胞具有向不同的間質組織多向分化的能力，因此進行多系定向誘導來證明其多向分化能力是鑒定ADSC的一個較好的方法。目前已有許多研究證實了ADSC在不同培養基的條件下能夠向中胚層細胞系包括脂肪、軟骨、骨、肌細胞和其他胚層細胞系包括神經、內皮、心肌細胞等轉化［7］。這有力的說明了ADSC是真正意義上的具有多向分化潛能的干細胞，而不是多種異源性細胞的簡單混雜。

3 HGF的生物學特性

MSC在培養過程中可分泌HGF、VEGF等生長因子，而HGF(肝細胞生長因子，hepatocyte growth factor，HGF)作為一種多效性細胞因子，其在器官形成、組織修復、血管再生等方面中早已被證實具有重要的作用，尤其是胃黏膜組織所分泌的HGF對維持黏膜上皮細胞形態及功能、促進毛細血管增生等方面的作用更是明顯［8］。而ADSC也同樣被證實了可分泌HGF、VEGF等生長因子［9］，因此利用ADSC移植治療GU的過程中，ADSC及其分泌的HGF或可在改善黏膜潰瘍、提高胃壁厚度等方面起到協同作用。

HGF在潰瘍黏膜修復中主要參與了上皮重建和上皮細胞分裂增殖這兩個過程。正常胃黏膜下的黏膜下層、肌層、漿膜層即有HGF基因轉錄，NSAID誘導的急性黏膜損傷時HGF mRNA表達增多，在醋酸誘導的胃潰瘍邊緣也發現了HGF基因的高表達［10］。HGF在促進損傷黏膜殘存細胞遷移移植的同時還可誘導上皮細胞分化成胃腸腺管狀結構。HGF還能夠抑制肝、心、肺等纖維化組織中轉化生長因子-β1(transfor-ming growth factor-β1，TGF-β1)的產生和增強膠原酶的活性［11］。這說明HGF在刺激胃黏膜上皮和潰瘍面微血管內皮的增殖、運動，加速潰瘍的愈合的同時，還可能抑制膠原的合成和沉積，減少愈合后的潰瘍瘢痕，有利于防治潰瘍瘢痕性幽門梗阻的發生，改善GU的預后。由此可見HGF在GU的治療過程中所扮演的角色的重要性。

4 ADSC與HGF的相關研究進展

盡管已經證實了ADSC和MSC一樣具有多向分化潛能，但是目前關于ADSC向上皮細胞分化的研究仍不多。2005年Brzoska等［12］在體外成功誘導了ADSC向上皮細胞的分化。2007年Paunescu等［13］的研究則發現HGF是促使MSC向上皮細胞分化的重要因子之一。可以預期，通過移植ADSC進入受損的胃黏膜中，除了ADSC本身可能向胃黏膜上皮細胞分化外，其分泌的HGF亦在ADSC的上皮分化過程中起到一定的誘導作用，從而達到創面修復和黏膜下組織重建的目的。

Cai等［14］的研究發現抑制HGF的表達會降低ADSC促進缺血組織血管再生的能力，提示HGF是影響ADSC治療效果的關鍵因素。Okada等［15］的研究發現MSC移植可促進血管生成并抑制炎癥因子的產生，且這些變化與HGF的表達增加有關。近年來有觀點認為應當關注MSC在低氧狀態下的組織修復作用，因為當MSC被作為治療工具移植用于組織修復時，其周圍環境的氧含量會從體外培養的21%轉至缺血組織的不足1%，且在生理條件下，MSC在骨髓或其他部位，其生長、增殖環境均為低氧分壓。相關研究［16］發現，缺血肌肉的HGF表達增多，低氧可誘導MSC表面c-Met受體的表達，經低氧預處理的MSC更容易移植并發揮更大的組織修復作用。可見，在利用ADSC移植治療GU的過程中，HGF的表達量以及其生物學作用是否能充分發揮，與ADSC是否能順利分化并發揮療效息息相關。

目前尚未有誘導ADSC向胃黏膜上皮細胞分化以治療GU的研究報道。但ADSC表現出的多向分化潛能及可向上皮細胞分化的特性，提示其移植于受損的潰瘍創面后，可能會起到修復受損的胃黏膜上皮組織，恢復其防御屏障功能并提高潰瘍愈合質量的重要作用。而ADSC分泌的HGF亦可與ADSC協同作用，在促使ADSC向胃黏膜上皮細胞分化的同時，刺激血管內皮細胞的遷移、增殖，形成新生血管，增加黏膜血供，并抑制炎癥反應和減少纖維組織增生，從而促進潰瘍愈合。近年來，隨著基因轉染技術的日益發展，通過構建HGF質粒轉染ADSC來移植治療GU或可使ADSC和HGF在潰瘍創面修復中的協同作用得到充分發揮。由于MSC具有免疫逃逸特性，其一直被認為是理想的組織工程和基因載體細胞。經過HGF基因修飾的MSC能持續穩定的表達HGF并作用于潰瘍創面，克服了HGF半衰期短的缺點;HGF可抑制細胞凋亡的特性亦可使載體干細胞長時間存活在創面，從而更有利于其分化為胃黏膜上皮細胞;HGF抑制TGF-β1的產生和增強膠原酶活性的特性也促使ADSC刺激形成的多余膠原得到有效降解，減少潰瘍愈合后的瘢痕。目前已有研究采用經HGF修飾的MSC進行移植治療，并明確了其在組織修復再生方面的療效［17］。而ADSC亦是一種理想的基因載體。Zhu等［18］通過慢病毒介導轉染HGF至ADSC，并將轉染后的ADSC用于移植治療急性心肌梗死，結果發現轉染后的ADSC通過促進血管生成、抑制心肌纖維化而改善左室功能，且HGF增強了血管生成和抗纖維化的效果。由此可見，利用HGF轉染ADSC移植治療GU，是值得期待的一種治療手段。

雖然現階段已有大量ADSC的相關研究，但是仍有問題等待解決:①目前尚未建立起ADSC的鑒定篩選標準:現有的各個實驗研究在分離培養ADSC的過程中，在脂肪組織取材部位、采用的膠原酶類型、消化時間均有所差異，故無法排除由于實驗條件不同所獲得的ADSC存在差異的可能性;且分離獲得的細胞群雖然主要組分是ADSC，但仍有可能混雜低水平的造血細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和周細胞(pericyte)。因此尋找到ADSC的特異性標志物，制定標準的分離、培養和純化方法對其的臨床應用具有重要意義。②誘導ADSC向各類型細胞分化的信號種類、分子機制、基因調控方式尚不明確:目前ADSC的體外誘導多是在誘導培養基中加入不同的生長因子或化學物質等促進其向不同類型的細胞分化，這些誘導劑發揮作用的機制、誘導劑間的相互作用、最佳效量比和序貫應用的方法等問題尚無明確答案。因此要將ADSC運用于組織工程，有必要對ADSC的多向分化，尤其對其分化能力、生長因子及潛在的信號調控機制作進一步研究。③體外培養的ADSC，最終要移入體內進行研究，所以ADSC在體內誘導分化的條件、選擇合適的動物模型、種子細胞移入體內所需的合適載體仍有待探尋。

盡管如此，ADSC的多向分化能力、免疫原性弱、可分泌HGF等生長因子協同發揮組織修復作用等特性，以及其相比較BDSC具有提取方法簡單、細胞數量大、取材創傷性小等優點，使其在組織工程、基因治療、細胞移植等多方向的研究中顯示出獨特的優勢。有理由相信隨著研究的逐漸深入，利用ADSC移植治療GU，有望成為一種新穎的治療手段，并顯示出廣泛的臨床應用前景和極高的科研價值。

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Roles of adipose-derived stem cells and hepatocyte growth factor in the treatment of gastric ulcer

CHEN Zhi-feng，HUANG Cong-wu.Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Shantou U-niversity Medical College，Shantou 515041，China

Peptic ulcer is one of the world's most common ailments，and the high recurrence rate remains a major problem following the treatment of peptic ulcer.Adipose-derived stem cells(ADSCs)have multiple differentiation ability and secrete growth factors such as hepatocyte growth factor(HGF)and vascular endothelial growth factor(VEGF).Therefore，transplantation of ADSCs may strengthen the gastric mucosal barrier in gastric ulcer patients，and this may become a potential new therapy for gastric ulcer.This article reviews the current status of treatment of peptic ulcer，the characteristics of ADSCs and HGF，and the recent advances in ADSCs and HGF．

Adipose derived stem cell;Hepatocyte growth factor;Gastric ulcer;Transplantation; Gene transfection

515041汕頭大學醫學院第二附屬醫院消化內科

黃聰武E-mail:huangcw9988@yahoo.com.cn