血漿EBV-DNA與VCA-IgA聯合檢測對鼻咽癌診斷的意義

范國宇 劉偉

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國常見的惡性腫瘤，大多NPC患者就診時已經出現頸部淋巴結轉移甚至遠處轉移，尚缺乏有效的分子標志物［1］。大量資料顯示EB病毒和鼻咽癌有密切關系［2］，鼻咽癌患者外周血中存在多種EB病毒的相關抗原、抗體，長期以來，檢測EB病毒殼抗原IgA抗體(VCA-IgA)是鼻咽癌診斷的主要輔助指標，但因其假陽性較高，為鼻咽癌的早期診斷帶來一定困難［3］，近年來發現血漿EBV-DNA水平是一種可靠的監測指標［4］，血漿EBVDNA水平與體內腫瘤負荷呈正相關［5］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年12月至2010年9月于我院確診為鼻咽癌患者88例，所有患者初診時均經病理學診斷為鱗癌，其中男57例，女31例，年齡24～68歲，中位年齡45歲。同期行健康體檢者45例作為對照組，男30例，女15例，年齡36～70歲，中位年齡50歲，排除患有腫瘤性疾病。

1.2 臨床分期 根據1992年全國鼻咽癌福州會議推薦的分期［6］。早期鼻咽癌患者38例，其中Ⅰ期21例、Ⅱ期17例，晚期鼻咽癌患者50例，其中Ⅲ期28例、Ⅳ期22例。

1.3 標本收集和實驗室檢查 ①EVB-DNA熒光定量PCR試劑盒購自深圳達安生物技術公司，熒光定量PCR儀為MJ公司OPTICON2型，每個研究對象空腹抽取外周靜脈血2 ml，加入EDTA抗凝管中，1600 g離心后分離上層血漿，置于-20℃凍存。每份血漿標本取50 μl用QIAamp Blood Kit試劑盒抽取血漿DNA。血漿中EVB-DNA含量計算如下:C:EVBDNA拷貝數(ml);Q:PCR擴增后計算機檢測的原始DNA拷貝數;VDNA:抽取的DNA稀釋液體積;VPCR:用于PCR擴增的DNA體積;Vext:用于抽取DNA的血漿體積;公式:C(ml)=Q(VDNA/VPCR)(1/Vext)［7］。血漿 EVB-DNA含量結果大于0 copies/ml為陽性。②常規的免疫酶法檢測血漿VCA-IgA，滴度大于1∶40為陽性。

1.4 統計學方法 所有實驗數據應用SPSS 10.0統計軟件包進行統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度檢測結果 鼻咽癌患者EVB-DNA水平檢出陽性率81.82%，陰性率18.18%，中位拷貝數3.8×103copies/ml(3.9×102～6.1×104copies/ml)。健康對照組EVB-DNA水平檢出陽性率6.67%，陰性率93.33%，中位拷貝數0 copies/ml(0-58 copies/ml)，兩組陽性率差異有統計學意義(u檢驗，u=10.24，P＜0.01)，鼻咽癌患者血漿VCA-IgA滴度檢出陽性率89.77%，陰性率10.23%，健康對照組血漿VCA-IgA滴度檢出陽性率31.11%，陰性率68.89%，兩組陽性率差異有統計學意義(u檢驗，u=7.06，P＜0.01)。

2.2 NPC患者不同臨床分期血漿EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度檢測結果 比較鼻咽癌患者不同TNM分期的血漿EVBDNA水平檢測結果，Ⅰ期與Ⅱ期之間沒有統計學差異(P=0.72)，與Ⅲ期、IV期之間有統計學差異(F=3.41，P=0.016)，Ⅱ期與Ⅲ期、IV期之間有統計學差異(F=4.12，P=0.008)，Ⅲ期與IV期之間沒有統計學差異(P=0.65);比較鼻咽癌患者不同TNM分期的血漿VCA-IgA滴度檢測結果，Ⅰ期與Ⅱ期之間沒有統計學差異(P=0.76)，與Ⅲ期、IV期之間有統計學差異(χ2=15.6，P=0.004)，Ⅱ期與Ⅲ期、IV期之間有統計學差異(χ2=7.64，P=0.048)，Ⅲ期與IV期之間沒有統計學差異(P=0.93)。晚期鼻咽癌患者EVB-DNA中位拷貝數與早期比較，III、IV期患者血漿EVB-DNA中位拷貝數是Ⅰ期、Ⅱ期患者的6倍(P=0.001)，有顯著差異。

2.3 血漿EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度的關系 88例鼻咽癌患者中，有16例患者未檢測出EVB-DNA，其VCA-IgA均為陽性，滴度≥1:40，其中12例滴度≥1:20，有9例患者未檢測出VCA-IgA，其中8例檢出 EVB-DNA，中位拷貝數1.8×102copies/ml(31～2.3×103copies/ml)，只有1例陰性。45例對照組中，有3例檢測出EVB-DNA，中位拷貝數0 copies/ml(0～30 copies/ml)，有1例VCA-IgA陽性，滴度為1∶20。

3 討論

鼻咽癌的特點是惡性程度高，有些患者在鼻咽鏡檢查尚未發現原發灶時，就有淋巴結轉移。Cannon等報道約73%的患者有誤診或延誤，內鏡技術為鼻咽部檢查提供了直觀、放大圖像，但是難以發現黏膜下腫瘤，敏感性只有62%［8］。患者外周血中存在多種EB病毒相關的抗原、抗體，早期多采用血漿VCA-IgA作為篩查以及評價鼻咽癌治療效果的血液學指標，由于抗體水平的變化落后于患者體內EBV病毒的變化，不能靈敏的反應腫瘤消長變化。近年來大量資料顯示血漿EVB-DNA與鼻咽癌關系密切，其水平可以反映腫瘤的負荷，與腫瘤的惡性程度有正比關系。本組研究顯示，鼻咽癌患者組EVB-DNA的檢出陽性率為81.82%，健康對照組陽性率為6.67%，前者中位拷貝數3.8×103copies/ml，后者中位拷貝數0 copies/ml，鼻咽癌患者的陽性率顯著高于對照組，進一步證實了鼻咽癌與EB病毒的關系。在鼻咽癌患者組的臨床分期中，陽性率也有差異，主要表現為Ⅰ期、Ⅱ期患者的陽性率及中位拷貝數均低于Ⅲ期、IV期患者，說明EBV-DNA水平與患者體內腫瘤負荷呈正相關，可能是由于血漿EBV-DNA由腫瘤細胞釋放入外周血的結果。本研究還應用常規的免疫酶法檢測了血漿VCA-IgA滴度，鼻咽癌患者血漿VCA-IgA陽性率為89.77%，對照組31.11%，兩組有顯著差異，79例血漿VCA-IgA陽性患者中，其抗體滴度均≥1:20，88例患者中，有16例患者未檢測出EVB-DNA，其VCA-IgA均為陽性，滴度≥1:40，其中12例滴度≥1:20，進一步證實了血漿VCA-IgA的診斷價值，說明這兩種檢測方法對鼻咽癌的診斷具有互補作用，符合相關研究的結論。綜上，同時檢測外周血EVB-DNA水平和VCA-IgA滴度，對于鼻咽癌患者的診斷有極高價值，該方法經濟有效，適用于門診及病房對鼻咽癌疑診患者的篩查，對已確診的患者病情進行評估，可作為監測病情的一種有效手段。

［1］Zhang Z，Sun D，Van do N，et al.Inactivation of RASSF2A by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma.Int J Cancer，2007，120(1):32-38.

［2］Lo KW，To KF，Huang DP.Focus on nasopharyngeal carcinoma.Cancer cell，2004，5(5):423-428.

［3］賈衛華，曾益新.鼻咽癌易感基因的研究.實用腫瘤雜志，2004，19(4):270-273.

［4］向燕群，郭翔，閔華慶.鼻咽癌分子標志物研究進展.實用腫瘤雜志，2004，19(4):273-275.

［5］季明芳，郭媛卿，梁錦勝，等.鼻咽癌患者發病前后EB病毒VCA/IgA和EA/IgA滴度動態分析.中華腫瘤雜志，2003，25(3):243.

［6］Lin JC，Wang WY，Chen KY，et al.Quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma.N Engl J Med，2004，350(6):2461.

［7］To EWH，Chan KCA，Leung SF，et al.Rapid clearance of plasma Epstein-Barr virus DNA after surgical treatment of nasopharyngeal carcinoma.Clin Cancer Res，2003，9(8):3254.

［8］Lo YM，Chan IY，Lo KW，et al.Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patiets with nasopharyngeal carcinoma.Cancer Res，1999，59:1188-1191.