替加環素聯合亞胺培南對黏液型銅綠假單胞菌的體外抗菌活性及生物膜抑制作用分析

鐘 峰， 馮 藝， 張晶晶， 許 巖， 方詠梅， 陶秀彬， 吳 競

（1.皖南醫學院第二附屬醫院檢驗科，安徽 蕪湖 241000；2. 安徽省婦幼保健院病理科，安徽 合肥230001；3. 皖南醫學院護理學院，安徽 蕪湖 241000）

銅綠假單胞菌是院內感染的主要病原菌之一，常引起肺部、尿路等多部位嚴重感染[1]。在進行侵入性治療時，插管、引流管等可引起外源性感染，也是導致細菌生物膜產生及誘發因素之一。有研究結果表明，銅綠假單胞菌生物膜與臨床感染毒力、耐藥性有主要關系，碳青霉烯類耐藥菌株的生物膜形成能力較敏感菌株明顯升高[2-3]。因此，亟需一種有效的用藥方案，以解決形成生物膜菌株的耐藥問題。

細菌生物膜是細菌在生長過程中為適應生存環境而形成的一種與浮游細胞相對應的生長方式，通過自身合成的多糖蛋白復合物黏附在固體表面，并在糖蛋白復合物中生長繁殖而形成的細菌群落[4]。大環內酯類抗菌藥物可通過抑制銅綠假單胞菌生物群體密度感應系統而抑制細菌生物膜的形成[5]，但由于大環內酯類抗菌藥物抗菌譜較窄，且耐藥率逐年升高，在臨床治療時往往效果并不理想。亞胺培南對革蘭陰性菌的抗菌活性較強，抗菌譜較廣[6]，但單獨使用穩定性差，且肝臟毒副作用大，對細菌生物膜的抑制及破壞作用較差。本研究擬探討替加環素聯用亞胺培南對黏液型銅綠假單胞菌（mucoidPseudomonas aeruginosa，MPA）的抗菌活性及生物膜抑制作用，為臨床抗感染治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2016年9月—2018年5月皖南醫學院第二附屬醫院分離自臨床樣本（痰、中段尿和分泌物等）的89株MPA，剔除分離自同一患者相同部位的重復菌株。質控菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 主要儀器和試劑

VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀、DR100型比濁儀（法國生物梅里埃公司），96孔細菌培養板、全功能微孔板檢測酶標儀（鄭州安圖生物公司），替加環素、亞胺培南（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），M-H培養基、MHB培養基（北京索萊寶公司）。

1.3 方法

1.3.1 體外藥物敏感性試驗 采用微量肉湯稀釋法測定替加環素和亞胺培南對89株MPA的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將替加環素和亞胺培南倍比稀釋成0.062 5～32 μg/mL系列濃度的菌液，分別注入無菌的96孔細菌培養板，每孔200 μL，每排設2個空白對照孔，用MHB營養肉湯將培養18～24 h的MPA配制成濃度為1.0×106CFU/mL的菌液，每孔加入200 μL，混勻，放入37℃溫箱培養16～20 h后觀察結果，此MIC為無菌生長的最低藥物濃度。

1.3.2 聯合用藥效果評價 采用棋盤滴定法測定替加環素和亞胺培南體外協同效應，用MHB營養肉湯將替加環素和亞胺培南倍比稀釋成0.062 5～32 μg/mL系列濃度的菌液，以棋盤法將不同濃度的藥物兩兩組合，加入到96孔細菌培養板中，再加入濃度為1.0×106CFU/mL的菌液，設置陰性對照（MHB培養基）和陽性對照（不加藥物），放入37℃溫箱培養16～20 h后觀察結果，兩藥聯合的MIC為微孔內液體澄清的最低藥物濃度。采用分級抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）判定2種藥物聯用對MPA的抑菌作用。FICI=聯用時A藥的MIC/單A藥的MIC+聯用時B藥的MIC/單B藥的MIC。判定標準：FICI≤0.5為協同作用，0.5＜FICI≤1為相加作用，1＜FICI≤2為無關作用，FICI＞2為拮抗作用[7]。

1.3.3 時間殺菌曲線實驗 設置0.5 MIC亞胺培南組、0.5 MIC替加環素組、0.5 MIC亞胺培南+替加環素組、對照組（MIC為0）4個組。菌液濃度均為1.0×106CFU/mL，抗菌藥物終濃度為該藥物的亞MIC。混勻后放入37℃搖床內培養，分別于0、2、6、12、24 h吸取100 μL培養液，用無菌0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋4次后涂板，常規培養18～24 h后計數，取計數值的對數繪制出時間殺菌曲線，根據菌落計數判斷2種藥物聯用后的殺菌效應。殺菌/抑菌效應定義：培養24 h細菌濃度比初始接種細菌濃度降低＞3 log10CFU/mL；協同效應定義：培養24 h聯合組細菌濃度比最強單藥組細菌濃度降低≥2 log10CFU/mL[8]。

1.3.4 生物膜抑制實驗 將替加環素和亞胺培南聯合用藥為協同作用效應的6株MPA[3]和質控菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）分別接種于MHB培養基中，37℃培養箱內培養過夜，用比濁儀將菌液濃度分別調整為1.0×106CFU/mL，注入無菌96孔細菌培養板（質控菌株為陽性對照，空白對照孔內只加MHB），用MHB培養基分別將替加環素稀釋成1、1/2、1/4 MIC系列濃度，將亞胺培南稀釋成1、1/2、1/4 MIC系列濃度。以棋盤法將不同濃度的替加環素和亞胺培南進行兩兩組合，37℃培養24 h后，棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液沖洗2遍，加入100%甲醇200 μL固定20 min，棄去固定液后加入0.5%結晶紫染色20 min，蒸餾水沖洗后晾干，加入33%冰乙酸200 μL。用酶標儀檢測96孔板內液體在波長570 nm處的吸光度（A570nm）值，每株菌株設立3個復孔，計算經抗菌藥物作用組與未經抗菌藥物作用組的A570nm均值，均值越低，表示抗菌藥物對生物膜的抑制能力越強。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，呈正態分布的數據以±s表示，組間比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗菌藥物單用及聯用對MPA的MIC比較

采用微量肉湯稀釋法檢測替加環素、亞胺培南單用及聯用對89株MPA的MIC，得出的MIC分別為0.0625～2 μg/mL和0.125～2 μg/mL，89株MPA均為敏感菌株。MIC50分別為0.25 μg/mL和1 μg/mL，MIC90分別為0.5 μg/mL和2 μg/mL（表1）。FICI指數結果分析得出2藥聯合應用對MPA的協同作用為46.07%（41株）、部分協同作用為14.6%（13株）、相加作用為12.36%（11株）、無關作用為26.97%（24株）、無拮抗作用。2種藥物聯用對89株MPA的累計抑菌百分率（cummulative inhibitory ratio，CIR）見圖1。相比單獨用藥，替加環素與1/2 MIC亞胺培南聯用的累計抑菌曲線明顯左移，在相同CIR下，替加環素與亞胺培南聯用較單用所需的藥物濃度低。在相同的給藥濃度下，聯合用藥的抗菌作用明顯增強。

表1 替加環素與亞胺培南單用及聯用對MPA的MIC μg/mL

圖1 替加環素與亞胺培南單用及聯用對MPA的MIC CIR曲線

2.2 替加環素與亞胺培南聯合抗菌實驗結果

選取亞胺培南和替加環素聯合用藥有協同作用的6株MPA，在聯合應用亞胺培南和替加環素24 h后菌落數均減少，較最強單藥組濃度降低≥2 log10CFU/mL，聯合用藥對6株MPA均表現為協同作用。見圖2。

2.3 亞胺培南和替加環素對MPA生物膜的體外作用效應

在無亞胺培南作用時，1/4、1/2 MIC替加環素與對照組比較，差異無統計意義（P＞0.05）；加入1/4、1/2或1 MIC替加環素后與單獨使用1/4 MIC替加環素相比，A570nm值明顯下降（t值分別為2.45、2.24、2.07，P＜0.05）。在無替加環素作用時，1/4、1/2 MIC亞胺培南與0 MIC比較，差異無統計意義（P＞0.05）；加入1/4、1/2或1 MIC替加環素后與單獨應用1/4 MIC亞胺培南相比，A570nm值明顯下降（t值分別為2.47、2.35、2.16，P＜0.05）。見表2。

圖2 替加環素（1/2 MIC）與亞胺培南（1/2 MIC）單用及聯用的時間殺菌曲線

表2 替加環素聯合亞胺培南對MPA生物膜的作用效應（A570nm值） ±s

表2 替加環素聯合亞胺培南對MPA生物膜的作用效應（A570nm值） ±s

注：與同一濃度單用亞胺培南對照組（MIC=0）比較，* P＜0.05；與同一濃度單用替加環素對照組（MIC=0）比較，#P＜0.05

亞胺培南MIC替加環素MIC 0 0.261±0.006 0.214±0.005* 0.211±0.009* 0.136±0.004*1/4 0.248±0.005 0.189±0.008*# 0.175±0.006*# 0.129±0.01*1/2 0.227±0.004 0.164±0.005*# 0.136±0.001*# 0.125±0.005*1 0.128±0.007# 0.13±0.003# 0.126±0.006# 0.126±0.004 1/4 1/2 1 0

3 討論

銅綠假單胞菌的耐藥機制主要包括形成生物膜、主動外排系統和藥物滲透障礙等，特別是MPA黏液化與生物膜形成有關，一般認為MPA為形成生物膜的陽性菌株，MPA和非黏液型銅綠假單胞菌均能形成生物膜，但兩者形成生物膜的表型及階段特異性存在差異[9-10]。有研究結果表明，MPA比非黏液型銅綠假單胞菌感染持續時間更長，更不易清除，能夠使菌體逃脫宿主免疫系統的清除[11]，同時由于胞外黏多糖的屏障作用，使得抗菌藥物難以滲透入細胞內，導致MPA相關的慢性感染易反復，且難以清除，給臨床治療帶來嚴重困擾[12-13]。

近年來，由于多重耐藥銅綠假單胞菌不斷增多，且氨基糖苷類及喹諾酮類抗菌藥物的不良反應，碳青霉烯類抗菌藥物已成為治療首選，但是由于銅綠假單胞菌生物膜的形成，增加了其對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性。有研究結果表明，替加環素的抗菌作用機制是以陽離子-四環素類復合物穿過細菌外膜，積聚于包膜間質，再通過彌散方式透過細胞膜進入細胞質，并與核糖體30S亞基結合，阻斷氨酰基-轉移RNA進入A位點，通過阻斷肽鏈的延長來抑制細菌蛋白質的合成及細菌的生長[14]。本研究聯用亞胺培南和替加環素，計算FICI指數，分析得出2種藥物聯用對MPA主要為協同及相加作用，無拮抗作用，替加環素能明顯降低亞胺培南的MIC50值（P＜0.05），在相同的給藥濃度下，聯合用藥的抗菌作用明顯增強。

有生物膜的MPA對抗菌藥物的耐藥性逐漸增強，給臨床治療帶來極大困擾，單獨使用1種抗菌藥物難以清除生物膜。目前，在破壞細菌生物膜的方法中，碳青霉烯類抗菌藥物與小劑量大環內酯類抗菌藥物聯用效果較好[15]，但關于甘氨酰環素類抗菌藥物對黏液型細菌體外抑菌作用的研究較少，替加環素甘氨酰環素類抗菌藥物主要被用于治療復雜性腹腔及軟組織感染。有研究結果顯示，替加環素對鮑曼不動桿菌形成的生物膜具有明顯抑制作用，通常作為一、二、三線抗菌藥物治療失敗或對青霉素過敏及不能耐受其他藥物患者的治療選擇[16]。本研究結果顯示，替加環素能夠抑制MPA的生物膜，并且在MIC范圍內，隨著抗菌藥物濃度的增加，生物膜抑制的程度逐漸增加。但單獨應用不同濃度的亞胺培南（1/4、1/2 MIC）對生物膜的抑制作用無差異，可能是生物膜阻礙了亞胺培南進入生物膜內，導致殺菌作用被抑制。但在亞胺培南濃度相同的情況下，加入1/4或1/2 MIC的替加環素可以使細菌生物膜明顯減少；在替加環素濃度相同的情況下，加入1/4或1/2 MIC的亞胺培南也可以使細菌生物膜明顯減少，提示2種藥物聯用可明顯抑制MPA生物膜的形成。

抗菌藥物的不合理使用使多重耐藥菌日漸增多，單獨使用抗菌藥物難以完全清除處于生物膜保護下的細菌。抗菌藥物聯合應用不僅能協同抑菌，還可降低藥物的毒副作用及誘導突變耐藥作用。本研究發現，在體外亞胺培南聯合應用替加環素，不僅具有協同抑制MPA的效果，而且還能抑制生物膜的形成，臨床應用價值顯著。但這種協同作用局限于體外試驗，在體內是否有協同作用，仍需要更多的動物實驗和臨床試驗進一步驗證。