目測法APTT混合糾正試驗的鑒別能力評價

彭 政， 唐 寧， 鄒志平， 肖 芳

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，湖北 武漢 430030；2.積水醫療科技有限公司，湖北 武漢 430030；3.湖北省第三人民醫院急診科，湖北 武漢 430030）

活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）延長的潛在原因可分為三大類：缺乏凝血因子、存在凝血因子抗體、存在狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant，LA）。凝血因子自身抗體可對人體凝血產生重要影響，其中最為常見的凝血因子自身抗體就是凝血因子Ⅷ抗體[1]。獲得性血友病是一種在非血友病患者循環血中以出現凝血因子Ⅷ特異性自身抗體為特征的出血性、自身免疫性疾病，臨床較為罕見，因出血突然且嚴重，患者常因延誤診斷而死亡[2-3]。血友病是遺傳性凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ缺陷所致的一種出血性疾病，患者在創傷或手術中出血嚴重，常會出現嚴重合并癥。LA與多發性血栓形成、習慣性流產、系統性紅斑狼瘡、血小板減少癥有關，患者通常不伴出血，隱蔽性強，故對LA進行早期篩查尤為重要[4-5]。

目前，凝血因子Ⅷ抗體和LA的確證試驗有相關特定因子定量分析、改良Bethesda法、稀釋蝰蛇毒時間（Russell viper venom time，RVVT）法和硅化凝血時間（silicon clotting time，SCT）法，但這些方法成本高、費時、費力，會一定程度延誤患者救治。針對這一難題，國際血栓與止血學會推薦使用APTT混合糾正試驗，可快速判斷凝血異常是由凝血因子低下或缺乏引起，還是由抑制劑（如LA、凝血因子抑制劑）引起，幫助實驗室明確檢測方向[6]。但目前暫無公認的APTT混合糾正試驗檢測方法和結果判讀標準，不同實驗室使用的標準不一，對“糾正”的理解也存在差異。因弱抑制劑可在1∶1混合的狀態下被充分稀釋而消失，故當APTT、凝血酶原時間只是稍微延長時，APTT混合糾正試驗結果會出現一定的偏差。由于上述種種原因，使得開展APTT混合糾正試驗的實驗室不多。本研究旨在評價目測法APTT混合糾正試驗的鑒別能力，并將其與傳統Rosner指數法進行比較。

1 材料和方法

1.1 標本

收集華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院APTT延長患者標本62例，所有標本均經確證試驗確認，延長原因明確，其中22例為凝血因子Ⅷ抑制劑陽性標本，20例為內源性凝血因子缺陷標本，20例為LA陽性標本。未能及時檢測的標本-80 ℃（6個月）或-20 ℃（14 d）冷凍保存。采用CP2000凝血分析儀及APTT試劑[積水（日本）醫療株式會社]進行檢測。

1.2 正常混合血漿的制備

收集華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院新鮮凝血試驗標本20例，所有標本凝血四項結果均在正常范圍內，且無溶血、無黃疸，排除妊娠、肝炎病毒陽性及人體免疫缺陷病毒抗體陽性的患者標本[7]。標本充分混勻后，1 500×g離心10 min，取上層血漿于無菌杯中，并分裝于Eppendorf管中。同時取2份適量血漿，一份直接進行凝血四項檢測，另一份置于37 ℃水浴箱中溫育1 h，再進行凝血四項檢測。若2份標本凝血四項檢測結果均正常，則將該標本置于-80 ℃保存[8]。本研究因自制血漿成本低，使用方便，故未使用商品化正常混合血漿，但自制正常混合血漿不宜多次反復凍融。

1.4 方法

1.4.1 目測法APTT混合糾正試驗 將正常混合血漿于37 ℃水浴箱中復融5 min。（1）即時型糾正試驗。將正常混合血漿、患者血漿直接上機檢測，設置兩者混合比例模式；（2）延遲型糾正試驗。手工配置正常混合血漿和患者血漿混合比例，充分混勻后于37 ℃水浴箱中溫育2 h[9]，再上機檢測。見圖1、表1。

圖1 目測法APTT混合糾正試驗流程

表1 目測法APTT混合糾正試驗血漿混合比例

為了更加客觀地評價檢測結果，需對面積比（area rotio，AR）值進行分析。根據AR值將結果圖分為3種曲線型：抑制劑型、缺陷型和可疑抑制劑型[10]。在一個矩形中，對角線將其分為下三角形（Ⅰ區）和上三角形（Ⅱ區），當Ⅰ區面積等于Ⅱ區面積時，AR值為100%。當Ⅰ區面積大于Ⅱ區面積時，為凸曲線型，即抑制劑型（AR≥108%）；當Ⅰ區面積小于Ⅱ區面積時，為凹曲線型，即缺陷型（AR≤94%）；另有可疑抑制劑型（AR為95%～107%），圖形近似直線，但不能被歸為凸曲線型，該類型提示可能包含凝血因子抑制劑。見圖2。

圖2 模擬模式識別曲線

1.4.2 Rosner指數法 將正常混合血漿于37℃水浴箱中復融5 min。按Rosner指數法常用血漿的配置要求，配制1～3管血漿，管1正常混合血漿0.5 mL，管2正常混合血漿0.25 mL+患者血漿0.25 mL，管3患者血漿0.5 mL。將管1～3上機檢測，計算Rosner指數，即（1∶1混合血漿APTT—正常混合血漿APTT）/患者血漿APTT×100%。Rosner指數＞11提示可能為抑制劑型，Rosner指數＜11提示可能為缺陷型。

將3管血漿于37 ℃水浴箱中溫育1 h后，檢測管2 APTT，同時將溫育后的0.25 mL管1血漿與0.25 mL管2血漿混合，立即檢測APTT，記錄APTT差值。若差值＞10 s，則判斷為存在時間依賴性抗體。

2 結果

2.1 凝血分析儀檢測結果

即時反應曲線呈凹曲線型，延遲反應曲線呈凸曲線型，提示存在凝血因子抑制劑，見圖3。即時反應與延遲反應曲線均呈凸曲線型，提示存在LA，見圖4。即時反應與延遲反應曲線均呈凹曲線型，提示凝血因子缺陷，見圖5。

2.2 Rosner指數法與目測法APTT混合糾正試驗驗證結果

對于20例凝血因子缺陷標本，目測法APTT混合糾正試驗與Rosner指數法均能100%檢出，見表2。對于20例LA陽性標本，目測法APTT混合糾正試驗與Rosner指數法均檢出19例（7號標本2種方法均未能檢出），見表3。對于22例凝血因子抑制劑陽性標本，目測法APTT混合糾正試驗檢出21例（1號標本未能檢出），50%點差值法檢出21例（6號標本未能檢出），見表4。

2.3 3種方法檢測凝血因子缺陷、LA及凝血因子抑制劑的敏感性

圖3 凝血因子抑制劑標本曲線

圖4 LA標本曲線

圖5 凝血因子缺陷標本曲線

表2 凝血因子缺陷組2種方法驗證結果

表3 LA組2種方法驗證結果

表4 凝血因子抑制劑組2種方法驗證結果

對于凝血因子缺陷標本，目測法APTT混合糾正試驗與Rosner指數法的敏感性均為100.0%。對于LA陽性標本，目測法APTT混合糾正試驗與Rosner指數法的敏感性均為95.0%。對于凝血因子抑制劑陽性標本，目測法APTT混合糾正試驗與50%點差值法的敏感性均為95.5%。

3 討論

APTT混合糾正試驗是分析APTT延長原因簡單而實用的工具，但由于目前暫無公認的APTT混合糾正試驗檢測方法和結果判讀標準，且對何時需運用APTT混合糾正試驗也無共識，因此目前仍有許多醫院未開展此檢測項目，導致臨床醫生對部分不明原因的APTT延長結果判斷存在困惑。

目測法APTT混合糾正試驗、Rosner指數法及50%點差值法對內源性凝血因子缺陷、即時反應抑制劑、延遲反應抑制劑均有較高的鑒別敏感性。目測法APTT混合糾正試驗可直接通過觀察曲線區分三者，簡單、易判。

針對延遲反應抑制劑的判斷，本研究采用混合比例50%血漿溫育前后差值＞10 s作為判斷閾值，而華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院在采用STAGO全自動血凝分析系統（法國STAGO公司）時，以溫育1 h后延長3 s作為判斷閾值，提示存在較大系統間差異，難以標準化。目測法作為定性判斷方法，對系統依賴性較小，更有助于APTT混合糾正試驗的標準化。

目測法APTT混合糾正試驗采用凝血分析儀自動按比例混合血漿進行檢測，對標本需求量少，本研究只需125 μL患者血漿就可完成5點即時型糾正試驗，而傳統APTT混合糾正試驗標本需求量較大。此外，Rosner指數法只用到50%的混合比例，當APTT稍延長，存在弱抑制劑時，50%混合比例可能會使抑制劑因被稀釋而消失，而多點稀釋功能可減弱此影響。

綜上所述，目測法APTT混合糾正試驗可快速對APTT延長的可能原因進行初步鑒別，結果直觀，對操作要求較低，適用于不能隨時進行凝血因子抑制劑、LA檢測的臨床實驗室。