國產Precil C3510全自動血凝分析儀檢測常規凝血項目臨床評價

張 強， 林 靜， 宗曉龍， 孫 光，劉軍鋒

（1. 天津市第三中心醫院分院檢驗科，天津 300250；2. 天津醫科大學第二醫院檢驗科，天津 300211；3. 天津市公安醫院檢驗科，天津 300100；4. 中國醫學科學院 北京協和醫學院 泰達國際心血管病醫院檢驗科，天津 300457）

Precil C3510全自動血凝分析儀（簡稱Precil C3510）是國產全自動高通量血凝分析儀，可通過雙磁路磁珠法、發色底物法和免疫分析法檢測凝血、抗凝、纖維蛋白溶解系統功能[1]。眾所周知，儀器和試劑對血栓和止血實驗敏感性影響較大，任何因素導致結果的變化都會影響臨床抗凝藥物監測治療[2]。天津市第三中心醫院分院引進Precil C3510并在投入使用前，依據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相關指南要求，對Precil C3510的凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，Fib）及D-二聚體（D-dimer，DD）等項目不精密度、線性、抗干擾能力、參考區間進行驗證。同時，以STA-Compact全自動血凝分析儀（簡稱STA-Compact）為參考，應用Spearman相關分析、Passing-Bablok回歸分析及Bland-Altman圖對Precil C3510進行一致性評價。評價Precil C3510檢測口服華法林患者國際標準化比值（international normalized ratio，INR）與STA-Compact檢測結果的一致性。以STA-R Evolution全自動血凝分析儀（簡稱STA-R Evolution）檢測的抗Xa活性（0.3～0.7 IU/mL）為標準，探討Precil C3510監測普通肝素治療的APTT參考區間。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年3—7月天津市第三中心醫院分院門診、住院患者145例，其中65例未接受治療患者（男36例、女29例，年齡18～83歲）用于Precil C3510與STA-Compact一致性評價，40例接受普通肝素治療患者（男23例、女17例，年齡39～79歲）用于建立Precil C3510監測普通肝素治療APTT參考區間，40名口服華法林患者（男22例、女18例，年齡36～74歲）用于INR一致性評價。另選取同期40名志愿者，其中20名（男13名、女7名，年齡37～53歲）用于抗干擾試驗，另外20名（男10名、女10名，年齡25～59歲）用于驗證參考區間。全部志愿者均排除心臟、肺、肝臟等臟器疾病和腫瘤、嚴重腎臟疾病、嚴重糖尿病、血栓類疾病，近期未接受抗凝治療。采集所有研究對象清晨空腹靜脈血3 mL，用3.2%枸櫞酸鈉抗凝，2 000×g離心15 min分離血漿，4 h內完成檢測。樣本排除溶血、乳糜血、黃疸，血細胞比容＜55%。

1.2 試劑與儀器

Precil C3510的PT（批號176203011）、AP TT（批號173203012）、F ib（批號172803011）、DD（批號703111L）測定試劑盒購自深圳邁瑞公司。STA-Compact和STA-R Evolution的PT（批號113127）、APTT（批號112907）、Fib（批號113486）、抗Xa（批號003116）測定試劑盒購自法國Stago公司。SX-800i血液分析儀購自日本Sysmex公司。PT、APTT、Fib質控品（生理值047B-E239A，病理值049B-D231A]購自德國TECO公司。DD質控品（生理值1709111，病理值1709119）購自深圳邁瑞公司。膽紅素標準品購自美國Sigma-Aldrich公司。脂肪乳（主要成分為三酰甘油）購自無錫華瑞制藥公司。

1.3 Precil C3510性能評價

1.3.1 不精密度 根據CLSI EP15-A3指南[3]，分別對不同質控品進行檢測，連續5 d，每天重復5次，計算批內、批間均方（MS）、變異分量（V）和標準差（s）。V批內=MS批內，V批間=（MS批間-MS批內）/5，s批內=（V批內）1/2，s總=（V批內+V批間）1/2。以批內變異系數（coefficient of variation，CV）、實驗室總CV表示預期不精密度，CV=s×100%/。批內不精密度、實驗室總不精密度應在制造商要求標準范圍內。

1.3.2 抗干擾試驗 收集5 mL全血，1 500×g離心10 min，棄去上層血漿，用10 mL生理鹽水洗滌紅細胞3次。加入等體積蒸餾水，混勻，4 °C過夜。3 000×g離心30 min，取上清液，所得即為血紅蛋白純溶液，應用SX-800i血液分析儀測定血紅蛋白濃度。根據CLSI EP7-A2指南[4]，向志愿者混合血漿中分別加入血紅蛋白溶液、膽紅素標準品、三酰甘油，制備成一系列梯度濃度的樣本，未加為對照樣本，分別檢測PT、APTT、Fib、DD。計算觀察到的干擾效應的“點估計（dobs）”，；計算d臨界值，。其中，d是無null效假設規定值，Z1-α/2通常為0，查表為1.96，根據指南[5]通用要求，每個濃度水平重復測定次數（n）為3次。若|dobs|＞d臨界值，則表明該濃度干擾物對結果存在干擾。

1.3.3 線性試驗 選擇經STA-Compact檢測FBG分別為7.73 g/L[高值（high-value，H）]和0.62 g/L[低值（low-value，L）]，DD為9.53 mg/L（H）和0.48 mg/L（L）的血漿樣品。根據CLSI EP6-A指南[6]，分別按5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L制備混合血漿，用Precil C3510檢測Fib和DD，重復3次，計算，并進行線性回歸分析，決定系統（coefficient of determination，R2）應＞0.95[7]。

1.3.4 參考區間 應用Precil C3510檢測各樣品PT、APTT、Fib、DD。根據CLSI C28-A3指南[8]，檢驗數據正態性和離群值，計算各參數、s、95%可信區間（confidence interval，CI）。

1.4 Precil C3510與STA-Compact一致性評價

應用Precil C3510和STA-Compact同時檢測65例未接受治療患者血漿樣本PT、APTT和Fib。根據CLSI EP9-A3指南[9]，應用Spearman相關分析評價2臺儀器相關性，Passing-Bablok回歸分析評價系統差異及比例差異，Bland-Altman圖評價隨機差異及平均偏移。當Spearman相關系數（rs）＞0.975，Passing-Bablok回歸方程截距接近0、斜率接近1，95%偏移位于±1.96s區間內，且2臺儀器平均偏移在臨床接受區間[1/2 美國臨床實驗室修正法規（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA'88）允許總誤差]內，可認為2臺儀器有良好一致性。

分別根據2臺儀器APTT各自參考區間（Precil C3510為21～37 s，STA-Compact為37～44 s）將APTT定義為在參考區間內或延長。以Kappa檢驗比較2臺儀器APTT。當Kappa值＞0.8為一致性很好，0.6＜Kappa值≤0.8為一致性較好，0.4＜Kappa值≤0.6為一致性中等，Kappa值≤0.4為一致性較差[10]。

1.5 Precil C3510監測普通肝素治療的APTT參考區間

應用Precil C3510檢測APTT、INR，STA-R Evolution檢測抗Xa活性、抗凝血酶（antithrombin，AT）活性。排除INR＞1.5或AT＜30%及接受其他抗凝治療患者[11]。根據CLSI H47-A2指南[12]，通過APTT與0.3～0.7 IU/mL抗Xa活性線性回歸分析結果建立Precil C3510監測普通肝素抗凝治療的APTT參考區間。

1.6 2臺儀器檢測口服華法林患者INR的一致性

以STA-Compact作為參考系統，Precil C3510作為待測系統，比較2臺儀器INR檢測差異。40例口服華法林患者血漿樣本中，STACompact檢測INR 2.0～4.5為30例，INR＜2.0為5例，INR＞4.5為5例。根據CLSI H57-A指南[13]，Precil C3510 INR在治療監測范圍（2.0～4.5）內，至少85%的樣本應與參考系統檢測差異＜0.5。

1.7 統計學方法

采用MedCalc 18.2軟件進行統計分析。應用線性回歸分析確定Fib檢測線性及監測普通肝素治療APTT的參考區間。應用D'Agostino-Pearson檢驗正態性，Tukey檢驗分析離群值。應用Spearman相關分析、Passing-Bablok回歸分析、Bland-Altman圖分析2臺儀器一致性。應用Kappa檢驗分析2臺儀器APTT檢測一致性。

2 結果

2.1 Precil C3510性能驗證結果

2.1.1 不精密度 各參數生理值、病理值質控品批內不精密度為1.35%～7.73%，實驗室內總不精密度為1.53%～9.90%，均在制造商提供的允許范圍內。見表1。

表1 批內不精密度和實驗室內總不精密度驗證結果（n=25）

2.1.2 抗干擾能力 對照樣本PT、APTT、Fib、DD結果分別為（13.1±0.78）s、（29.8±1.89）s、（3.12±0.21）g/L、（1.16±0.17）mg/L，d臨界值分別為0.88、2.14、0.24、0.19。三酰甘油為3.2 mg/mL和4.0 mg/mL時|dobs|=0.19，＞d臨界值，對DD檢測結果存在負性干擾。其他濃度干擾物（血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素）對各項目測定值無明顯干擾（|dobs|＜d臨界值）。見表2。

表2 生物干擾物對Precil C3510檢測結果的影響

2.1.3 線性分析 Fib的回歸方程為Y=0.978 0X+ 0.121 3，R2為0.996 4；DD的回歸方程為Y=1.040 9X-0.057 31，R2為0.993 9。Precil C3510 Fib、DD具有良好的檢測線性。見表3、圖1。

2.1.4 參考區間 20名志愿者PT、APTT、Fib、DD均呈偏態分布，且未發現離群值，采用百分位法表示，參考區間驗證選擇95%CI（P2.5～P97.5）。PT、APTT、Fib、DD95%CI分別為11.4～13.2 s、21.4～31.3 s、2.51～3.63 g/L、0.33～0.81 mg/L，均在制造商建議的參考區間（PT為9.2～15 s、APTT為21～37 s、Fib為2～4 g/L、DD為0～1 mg/L）內。

2.2 2臺儀器一致性評價

Precil C3510和STA-Compact的PT、Fib相關性較好（rs分別為0.990和0.989），Passing-Bablok回歸分析結果顯示，2臺儀器PT、Fib無系統差異[PT截距（95%CI）為-0.060 7（-0.658 1～0.719 1），Fib截距（95%CI）為-0.146 4（-0.253 8～0.000 4）]和比例差異[PT斜率（95%CI）為1.024 8（0.989 4～1.057 8），Fib斜率（95%CI）為1.013 7（0.964 3～1.056 7）]。Bland-Altman圖顯示，PT[95.38%（62/65）]的偏移位于±1.96s區間內]、Fib[96.92%（63/65）]的偏移位于±1.96s區間內]，均無隨機差異，且兩者平均偏移均在臨床可接受范圍內[PT為2.6%（1.4%～3.8%），Fib為-8.2%（-10.1%～-6%）]。2臺儀器APTT相關性一般（rs=0.916），且存在系統差異[截距（95%CI）為-18.121 6（-26.003 9～-12.522 1）]、比例差異[斜率（95%CI）為1.261 8（1.123 4～1.435 6）]及隨機差異[（92.31%（60/65）]的偏移位于±1.96s區間內，平均偏移[-18.9%（-22.9%～-14.9%）]不在臨床接受區間內（表4、圖2）。65例未接受治療患者樣本經STA-Compact檢測，APTT在參考區間內（37～44 s）23例、延長（＞44 s）42例；經Precil C3510檢測APTT在參考區間內（21～37 s）25例、延長（＞37 s）40例。2臺儀器對APTT測定值的臨床判定具有很好的一致性（Kappa=0.87，95%CI為0.74～0.99）。

表3 線性范圍驗證結果 g/L

圖1 Fib、DD線性分析

表4 2臺儀器一致性的比較

圖2 2臺儀器一致性比較

2.3 Precil C3510監測普通肝素治療APTT參考區間

抗Xa活性在0.3～0.7 IU/mL時，Precil C3510監測普通肝素治療APTT參考范圍為62～108.1。見圖3。

2.4 口服華法林患者2臺儀器INR一致性評價

2臺儀器口服華法林患者INR檢測結果比較，87.5%（35/40）的樣本差異＜0.5，其中治療監測范圍（2.0～4.5）內90%（27/30）的樣本差異＜0.5。見圖4。Precil C3510

圖3 普通肝素抗凝治療范圍

圖4 口服華法林患者INR結果

3 討論

本研究依據CLSI系列指南對Precil C3510檢測PT、INR、APTT、Fib、DD不精密度、抗干擾能力、Fib線性進行評估驗證。在不精密度驗證中，CLSI有EP5-A3和EP15-A3指南可供選擇。EP5-A3指南常用于儀器制造商建立不精密度聲明，但其操作繁瑣、測試量較大、試劑成本較高。對實驗室來說，可選擇周期更短、實用性更強，且更為簡易的EP15-A3指南對制造商提供的不精密度聲明進行驗證[2]。本研究依據EP15-A3選擇生理值、病理值2個水平商業化非定值質控品進行不精密度驗證，每天檢測5次，連續5 d。結果顯示，各項目批內不精密度為1.35%～7.73%，實驗室內總不精密度為1.53%～9.90%，均低于制造商聲明。Precil C3510是以磁珠法對PT、APTT、Fib進行測定，以免疫比濁法對DD進行檢測。相較于免疫比濁法，磁珠法可有效避免溶血、乳糜血、黃疸等光學信號干擾物和渾濁樣本本底影響，是凝固法檢測原理的金標準，在臨床中應用更廣泛[1]。本研究通過向患者血漿中加入外源性生物干擾物進行抗干擾試驗，結果顯示，各項目在血紅蛋白濃度為1～5 mg/mL、膽紅素濃度為0.06～0.30 mg/mL時均無明顯干擾；PT、APTT、Fib在三酰甘油濃度為0.8～4.0 mg/mL時無明顯干擾，DD在三酰甘油濃度為3.2～4.0 mg/mL時存在明顯負性干擾。因此患者三酰甘油高于3.2 mg/mL（3.61 mmol/L）時，DD結果需進一步實驗證實。在線性試驗中，PT、APTT檢測結果是通過儀器直接讀取，不適合進行線性分析，因此本研究僅驗證Fib、DD線性，結果顯示Fib（0.69～7.63 g/L）、DD（0.49～9.49 mg/L）有良好的檢測線性。20名志愿者血漿樣本各項目測定值95%CI均在試劑說明書提供的參考區間內。

在2臺儀器檢測結果的相關性研究中，我們發現2臺儀器間PT和Fib具有良好的一致性，而APTT則顯示出顯著的差異。Passing-Bablok回歸方程和Bland-Altman圖顯示，2臺儀器APTT測定值存在系統差異、比例差異和隨機差異，且偏移超出臨床接受區間。這種檢測差異可能與2臺儀器配套的APTT試劑成分差異有關。Precil C3510配套APTT試劑激活物為鞣花酸，而STRCompact配套試劑激活物為硅土。不同的APTT試劑激活劑類型、磷脂成分和濃度均會對結果產生影響，特別是血漿中存在肝素、狼瘡抗凝物、接觸因子缺乏等情況時，結果可能存在更大差異[14-15]。這種差異在制造商提供的生理參考區間中也得到了體現，Precil C3510的APTT參考區間為21～37 s，STR-Compact為37～44 s。我們依據2臺儀器各自的參考區間，將全部樣本分為APTT在參考區間內和延長后，應用Kappa檢驗分析，結果顯示2臺儀器對APTT測定值的臨床判定具有較好的一致性（Kappa=0.87，95%CI為0.74～0.99）。因此，我們認為盡管2臺儀器APTT測定值之間具有顯著的差異，但不會由此導致不同的臨床決策。

APTT對內源性凝血途徑凝血因子（凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ，前激肽釋放酶和高分子量激肽原）的缺陷敏感，因此通常用于臨床監測普通肝素的抗凝治療效果。由于不同儀器、試劑間APTT測定值的差異，基于APTT建立的監測參考區間也會存在差異。王霞等[11]應用Sysmex CA7000血凝分析儀和Dade Behring APTT試劑建立的監測參考區間為44.9～91.5 s。而GEENS等[2]應用Sysmex CS5100血凝分析儀及其配套APTT試劑（Actin FS）建立的監測參考區間為60～100 s。因此，建立基于實驗室在用儀器試劑系統的APTT監測參考區間，對臨床監測肝素抗凝治療效果具有重要意義。出于實際原因，某些實驗室采用體外連續稀釋普通肝素混合正常血漿來進行普通肝素APTT監測參考區間的確定。然而由于基質效應的存在，體外方法可能導致APTT治療范圍下限和上限的增加，產生更廣泛的治療范圍，從而不能準確地反映患者的肝素水平[16]。因此，CLSI相關指南推薦采用接受普通肝素抗凝治療患者的血漿樣本建立每個獨立實驗室的APTT監測參考區間[12]。值得注意的是，在建立APTT監測參考區間時尚需排除肝素抗凝劑影響，特別是以華法林為代表的維生素K拮抗劑可通過影響凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ合成導致APTT延長[11]。因此，本研究以INR＞1.5作為排除標準，以確保所篩選的病例未同時應用華法林等口服抗凝劑。此外，有研究發現肝素的抗凝血作用主要依賴于加強抗凝血酶（antithrombin，AT）的活性，而當AT活性＜30%時，肝素抗凝效果較差（肝素抵抗）[17]。因此，本研究選擇40例接受普通肝素抗凝治療患者的血漿樣本，并排除INR＞1.5、AT活性＜30%及應用其他抗凝劑患者，建立的本實驗室普通肝素APTT監測參考區間為62～108.1 s。

因考慮到所用特定分析系統（包括測試試劑/儀器組合），INR可實現不同實驗室不同儀器間PT測定結果的比較，便于用藥標準化。本研究選擇40例口服華法林患者，其中經STRCompact檢測INR在治療監測范圍（2.0～4.5）30例，INR＜2.0和INR＞4.5各有5例。比較2臺儀器INR檢測結果，發現無論在治療范圍內的30例樣本還是全部40例樣本，均有超過85%的樣本差異＜0.5 INR單位。因此根據CLSI H57-A指南，可認為2臺儀器在口服華法林療效監測中具有較好的一致性。

綜上所述，本研究對Precil C3510的性能及其在華法林療效監測和肝素治療中的臨床應用進行了較全面的評價，其各項檢測性能基本良好，可滿足臨床日常的診療需求。值得注意的是，2臺儀器APTT測定值仍存在顯著差異，這可能與儀器配套APTT試劑激活物不同有關。在應用各自參考區間重新評價APTT后，我們發現2臺儀器具有較好的一致性，APTT測定值的差異對臨床決策并未造成明顯影響。