FadD9重組蛋白在活動性肺結核診斷中的價值

張君麗， 林 晨， 王玉臣， 劉 軍， 袁 俐， 潘稚芬， 張 鷺

（1.復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；2.新疆石河子大學醫學院，新疆 石河子 832002；3. 嘉興學院附屬第一醫院 嘉興市第一醫院結核科，浙江 嘉興 314000）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的傳染性疾病，是單病因致死率較高的疾病之一。世界衛生組織2018年的報告顯示，全球有近1/4的人口（約23億人）被MTB感染過，每年新增結核病患者約960萬例，約有150萬死于結核病[1]。我國是全球22個結核病高危國家和地區之一，MTB的感染人數已超5億，結核病發病數約為450萬例[1]。MTB進入宿主后根據機體的免疫水平會呈現3種不同的結果：（1）被免疫系統清除；（2）未被徹底清除而發展成潛伏性結核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）；（3）形成活動性結核（active tuberculosis，ATB）。約有90%的MTB感染會發展成為LTBI[2]。LTBI是一種未出現臨床癥狀的持續性感染狀態，表現為結核菌素皮膚試驗陽性，但痰培養陰性且無影像學檢查征象[3]。隨著廣泛耐藥結核（extensive drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）患者及結核病合并人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者的增多，結核病防控形勢尤為嚴峻，主要的原因包括缺乏快速、準確的診斷技術，缺乏有效的抗結核疫苗和過長的結核病藥物療程（9～12個月）。現有的用于診斷MTB感染及區分ATB和LTBI的方法，如酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）和γ-干擾素釋放試驗（interferongamma release assay，IGRA）等都或多或少存在一些缺陷，敏感性與特異性難以兼顧[4]。篩選、優化哪些抗原或多肽用于MTB感染的診斷是研究者首先需要面對的難題，也是突破這一瓶頸的關鍵。目前，早期分泌靶抗原6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）和培養濾液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）是現有診斷方法的核心抗原，但在不同高危人群中進行活動性結核病篩查時，這2個抗原的檢測結果有時會不一致[5]，其原因尚待進一步研究。因此，篩選更多可用于臨床鑒別診斷的MTB候選抗原是提高結核病診斷能力的重要環節。fadD9（Rv2590）是MTB的一個脂質代謝相關基因，作為脂肪酸-CoA連接酶參與細菌脂質降解，具體功能還有待進一步探索。本研究團隊前期通過生物信息學表位預測，發現fadD9是一個很有潛力的診斷候選靶基因。為此，本研究擬探討通過基因表達和蛋白純化得到的FadD9重組蛋白在診斷MTB感染中的潛在價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 用于FadD9特異性抗體水平檢測的人群 選取2017年3月—2018年12月新疆石河子大學附屬醫院確診的活動性肺結核患者145例（活動性肺結核組），其中男65例、女80例，年齡（55.56±15.76）歲。選取同期與結核病患者有1年以上密切接觸史者38名（MTB密切接觸組），其中男17名、女21名，年齡（60.42±9.74）歲。選取同期新疆石河子大學附屬醫院體檢健康者101名（正常對照組），其中男51名、女50名，年齡（41.50±19.52）歲，均無結核病史及臨床結核病狀，且不曾與結核病患者接觸過。所有研究對象均無HIV感染，均有卡介苗接種史。以上人群的所有樣本均委托新疆石河子大學醫學院項目合作組收集、鑒定。生物醫學研究倫理學審查經新疆石河子大學醫學院附屬醫院倫理委員會審批通過。

1.1.2 用于基于FadD9重組蛋白的IGRA檢測的人群 選取嘉興市第一醫院2018年8—10月確診的肺結核患者58例，其中男40例、女18例，年齡（53±40）歲，均為痰涂片陽性或X線檢查具有結核影像學表現，且有相應的臨床癥狀。以同期嘉興市第一醫院就診的未感染MTB的其他患者34例作為對照（非肺結核組），其中男16例、女18例，年齡（51±35）歲，均無結核病史及臨床結核癥狀，且不曾與結核病患者有密切接觸史。所有研究對象均無HIV感染，均有卡介苗接種史。以上人群的所有樣本均委托嘉興市第一醫院收集。生物醫學研究倫理學審查經嘉興市第一醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 FadD9重組蛋白的制備和鑒定 在美國國立生物技術信息中心網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上獲取fadD9基因序列（基因 ID：888574）。以MTBH37Rv基因組為模板，用fadD9基因的上、下游引物（上游引物為5'-GT GGGATCCATGTCGATCAACGATCAGCGACT GAC-3'，下游引物為5'-TATAAGCTTTCACAG CAGCCCGAGCAGTCGCAG-3'）進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。PCR產物經酶切后連接至pET28a載體中，將構建好并經測序驗證正確的重組表達質粒轉入大腸埃希菌BL21（DE3）中，涂布在含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜，隨機挑取單個菌落接種至5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，進一步擴大培養至1 L。待菌液濁度達到0.6[600 nm處的吸光度（A）值]時加入1 mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactoside，IPTG）（終濃度為1 mmol/L）繼續誘導培養3～4 h，12 000×g離心1 min，收集菌體并用超聲裂解，4 ℃ 12 000×g離心10 min，收集上清液。FadD9重組蛋白的N末端帶有pET28a載體上的6個組氨酸標簽，可與鎳離子螯合，因此將Ni-NTA His·Bind Resin介質（美國Novagen公司）與收集的上清液混合后加入到空色譜柱中，按照介質說明書中的步驟進行純化，獲得FadD9重組蛋白。純化好的蛋白采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定純度。

1.2.2 FadD9抗原免疫原性分析 選取C57BL/6小鼠8只，每組4只，進行皮下免疫注射，其中FadD9免疫組注射50 μL FadD9蛋白與等體積弗氏佐劑（美國Sigma公司）的混合物，陽性對照組注射50μL Ag85a蛋白（陽性參照抗原）與等體積弗氏佐劑的混合物，陰性對照組注射等量的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）。小鼠分別在第1、3、5周進行免疫注射，第1次免疫注射使用弗氏完全佐劑，第2、3次使用弗氏不完全佐劑。首次免疫8周后分離小鼠脾臟淋巴細胞和小鼠血清，用ELISA分別檢測脾細胞γ-干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細胞介素-2（interleukin 2，IL-2）釋放水平及FadD9重組蛋白的特異性IgG抗體水平。

1.2.3 血清中FadD9重組蛋白與特異性抗體的反應性 以FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白為抗原包被96孔板，以活動性肺結核組、MTB密切接觸組和正常對照組的血清樣本分別作為一抗，按1∶100稀釋，二抗為過氧化物酶標記的山羊抗人IgG（美國CMCTAG公司），用前1∶3 000稀釋。檢測各組FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白抗原抗體特異性反應水平。

1.2.4 FadD9重組蛋白T細胞表位預測分析 使用NetMHCcons 1.1 Server和NetMHCⅡ2.3 Server在線網站，對選定的等位基因逐一進行分析，記錄預測得到的FadD9重組蛋白T細胞表位，分析FadD9重組蛋白與主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ和MHC-Ⅱ的結合能力[6-7]。

1.2.5 FadD9重組蛋白診斷結核病的價值 將FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白作為抗原與肺結核組和非肺結核組的全血樣本37 ℃共孵育20～24 h后，離心分離血漿并進行IGRA，試劑盒（ELISA）購自北京萬泰生物藥業股份有限公司。將檢測結果與試劑盒中的標準管進行比對，檢測FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白在臨床血漿樣本中激起的細胞免疫水平。

1.3 統計學方法

采用GraphPad prism 8.0.2軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估FadD9重組蛋白診斷肺結核的價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FadD9重組蛋白的制備和鑒定結果

FadD9重組蛋白均以可溶形式表達。純化后的FadD9重組蛋白經10%SDS-PAGE鑒定，蛋白純度＞95%。見圖1。

2.2 FadD9重組蛋白的免疫原性評估結果

檢測抗原免疫后小鼠血清中的IgG（H+L）效價可評估抗原激起的體液免疫水平。FadD9重組蛋白的A值變化與陽性參照抗原Ag85A蛋白基本一致，均高于陰性對照組。FadD9重組蛋白的血清抗體滴度達1∶12 800，與陽性參照抗原Ag85A蛋白接近。見圖2。

圖1 FadD9重組蛋白的制備和鑒定結果

采用ELISA分別檢測小鼠脾細胞的IFN-γ、TNF-α和IL-2水平。FadD9免疫組IFN-γ、TNF-α和IL-2水平分別為390.12、226.52、125.84 pg/mL ，三者比例為3.1∶1.8∶1.0。陽性對照組分別為333.97、190.84、159.0 pg/mL，三者比例為2.1∶1.2∶1.0。說明FadD9重組蛋白具有良好的免疫原性。

2.3 活動性肺結核組、MTB密切接觸組與正常對照組FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白的特異性抗體水平比較

活動性肺結核組抗FadD9抗體水平高于MTB密切接觸組和正常對照組（P＜0.000 1），MTB密切接觸組與正常對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。抗Ag85A抗體水平3組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2 FadD9免疫小鼠血清抗體水平

圖3 活動性肺結核組、MTB密切接觸組及正常對照組FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白特異性抗體水平的比較

2.4 FadD9蛋白T細胞表位預測結果

FadD9天然蛋白與不同人群的人白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR、HLA-A和HLA-B受體具有結合位點。使用NetMHCⅠ和NetMHCⅡ數據庫對FadD9重組蛋白T細胞表位進行初步分析。FadD9在2個數據庫中的19個亞型中至少具有4個以上強結合位點以及33個以上弱結合位點。見圖4。

2.5 FadD9重組蛋白診斷肺結核的效能

將FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白作為抗原與肺結核組和非肺結核組的全血樣本37 ℃共孵育20～24 h，然后進行IGRA，將檢測結果與試劑盒中的標準管進行比對。ROC曲線分析結果顯示，FadD9重組蛋白診斷肺結核的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.682，最佳臨界值為0.343，敏感性為96.8%，特異性為37.5%。見表2、圖5。

圖4 FadD9重組蛋白T細胞表位預測結果

表2 FadD9重組蛋白和IGRA標準管診斷肺結核的ROC曲線參數

圖5 FadD9重組蛋白與IGRA標準管診斷肺結核的ROC曲線

3 討論

FadD9（Rv2590）是MTB的脂質代謝相關基因，可能與脂質降解有關，但更多的生理功能仍有待進一步研究。NORTH等[8]的研究結果顯示，在小鼠模型中，FadD9抗原能夠誘導輔助性T細胞1（T helper cell 1，Th1）型細胞因子，尤其是IFN-γ，而IFN-γ被認為是控制MTB感染最重要的細胞因子，也是IGRA的效應因子，足量的IFN-γ分泌是IGRA診斷成功的前提。同樣由Th1分泌的TNF-α可將免疫細胞招募至感染部位，控制MTB在體內的散播，同時在肉芽腫的形成過程中也發揮著重要作用[9]。IL-2可促進細胞毒性T淋巴細胞的增殖[10]。這些細胞因子水平的升高提示FadD9蛋白在病原體-宿主相互作用的過程中發揮重要的細胞免疫調節作用，具有用于診斷試劑和疫苗開發的潛力。本研究結果顯示，FadD9重組蛋白激發的小鼠血清特異性抗體的水平與陽性參照抗原Ag85A蛋白接近，提示FadD9重組蛋白可同時在MTB感染者體內激起較高水平的體液和細胞免疫反應。另外，活動性肺結核組抗FadD9抗體水平高于MTB密切接觸組和正常對照組（P＜0.000 1），MTB密切接觸組與正常對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05），提示FadD9重組蛋白可用于活動性結核患者的相關血清學診斷試驗。

抗原激發細胞免疫的水平取決于其一級結構中細胞表位的數量。本研究選擇HLA-DRB、HLA-A和HLA-B亞群作為分析對象，HLA-DRB屬于MHC-Ⅱ型受體，可以識別超過90%的已知MTB抗原表位（約500個），刺激更多CD4+T細胞活化，釋放大量細胞因子，發揮抗結核的中心反應。HLA-A和HLA-B屬于MHC-Ⅰ型受體，可活化CD8+T細胞發揮細胞毒效應，在抗結核免疫中起重要作用[11-12]。本研究結果顯示，FadD9蛋白具有大量的T細胞表位，在人群中具有廣泛的一致性。結合FadD9蛋白能夠在小鼠中誘導出較強的Th1型細胞免疫反應，提示FadD9蛋白或許能在結核病患者中激發出具有診斷意義的細胞免疫反應。ROC曲線分析結果顯示，FadD9重組蛋白診斷結核病的AUC為0.682，表明FadD9重組蛋白具有用于以細胞免疫反應為基礎的IGRA的潛力。雖然與IGRA試劑盒中的標準管相比，FadD9重組蛋白的敏感性較低，特異性也有待提高，但考慮到IGRA試劑盒使用的抗原為2種以上的抗原組合，因此FadD9重組蛋白及部分表位肽或可作為新型抗原組合的候選成分。

目前，結核病的診斷金標準依然是病原學檢查，但大量痰培養陰性結核病、潛伏感染人群的存在以及MTB生長緩慢等特點，限制了病原學診斷的即時性和準確性。而免疫學檢測方法具有快速、靈敏和特異性高的優勢。目前，用于MTB感染診斷的免疫學方法較多，如ELISA、ELISPOT、IGRA等。ELISA是采用血清學方法診斷結核病，針對的是體液免疫。ELISPOT和IGRA針對的是細胞免疫，這2種方法的原理都是基于MTB感染后機體內存在具有抗原特異性的記憶T細胞，用特定抗原刺激記憶T細胞，使其迅速活化增殖，ELISPOT檢測的是合成IFN-γ的細胞數量，IGRA則檢測IFN-γ的分泌量。ELISPOT和IGRA使用的核心抗原均為ESAT-6和CFP-10，對ATB的診斷有較好的表現，但無法很好地鑒別LTBI。因此只適用于MTB感染的輔助診斷，無法區分新近感染和既往感染，其結果仍存在假陽性、對于LTBI敏感性低等缺點，尚無法替代痰涂片、培養或影像學等其他較為經典的診斷方法[13-14]。實現結核病的早期、快速、特異性診斷還有很長的一段路要走，改進或開發新型、高效的檢測試劑意義重大，其核心是病原菌關鍵抗原（簇）的發現和驗證。本研究結果顯示，與陽性參照抗原Ag85A蛋白比較，FadD9重組蛋白表現出了良好的免疫原性，并能引起較高的體液免疫和細胞免疫反應水平，具有用于開發成診斷試劑的潛力。后續將根據抗原T細胞表位預測結果，合成不同的抗原表位，進一步研究不同抗原表位用于結核病診斷的潛力；同時將FadD9重組蛋白/多肽與市售其他核心抗原混合使用，提高現有診斷抗原的敏感性和特異性，為診斷抗原的補充、檢測方法的優化提供拓展性思路與方法[15-16]。

總之，尋找新型的MTB生物標志物，提高診斷和鑒別診斷結核病的能力，對于結核病的早期診斷、療效監測及制定相關的防疫措施至關重要。