塊菌主要生理活性及活性物質(zhì)生產(chǎn)的研究進展

過 敏，唐麗薇，嚴金平，伊日布斯

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

塊菌主要生理活性及活性物質(zhì)生產(chǎn)的研究進展

過 敏，唐麗薇，嚴金平，伊日布斯*

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

塊菌是一種與高等植物根部共生的地下真菌，生物分類學(xué)上屬于子囊菌亞門、塊菌目、塊菌科、塊菌屬。塊菌具有多種生理活性，包括抗氧化、抗病原微生物、保肝、抗誘變、抗腫瘤、調(diào)節(jié)女性月經(jīng)周期和性功能等。該文較詳細地介紹了塊菌生理活性及獲得活性物質(zhì)的研究現(xiàn)狀，并對目前塊菌活性物質(zhì)研究中存在的問題和發(fā)展前景進行了討論和展望。

塊菌，生理活性，活性物質(zhì)

目前已被鑒定的塊菌有數(shù)百品種［1］。黑孢塊菌(T.Melanosporum)和白塊菌(T.magnatum)在歐洲(法國，西班牙，意大利和希臘)被譽為“上帝的食物”和“廚房里的黑鉆石”，售價昂貴，具有很高的經(jīng)濟價值。其中黑孢塊菌多產(chǎn)于法國佩里戈爾地區(qū)，故又稱為佩里戈爾黑松露(Périgord black)。白塊菌，通常產(chǎn)于意大利北部，皮爾蒙特地區(qū)［2－3］。在我國，塊菌主要分布在西南地區(qū)的四川、云南和西藏等地，其中云南產(chǎn)的印度塊菌(T.indicum)和四川產(chǎn)的中國塊菌(T.sinense)在外形上與黑孢塊菌相似，其作為食用塊菌的品質(zhì)亦可相媲美［4］。目前研究較多的塊菌包括黑孢塊菌(T.melanosporum)、冬塊菌(Tuber brumale)、夏塊菌(Tuber aestivum)、印度塊菌(Tuber indicum)、白塊菌(T.magnatum)、勃氏塊菌(Tuber borchii)、Tirmania nivea和Terfezia。其中后兩者通常被稱為沙漠塊菌，是地中海沙漠及半沙漠地區(qū)特有的品種［2－3］。

在歐洲，塊菌與魚子醬、鵝肝醬被稱為三大珍品，由于其獨特的芳香，深受歐洲人的喜愛，塊菌作為一種名貴的食用菌可以做成各種食品。根據(jù)品種的不同，國際市場上每公斤塊菌的售價可以達到600～60003。

塊菌含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，Singer R等［5］的研究表明，塊菌的蛋白質(zhì)含量普遍比其它食用真菌要高。Saltarelli等［6］測定了四種新鮮塊菌(T.melanosporum，T.aestivum，T.magnatum，T.borchii)的蛋白質(zhì)，其含量范圍在8.7%～24%(干重)之間，其中色氨酸，蛋氨酸和賴氨酸的含量最為豐富。另外塊菌中含有多種礦物質(zhì)如Si、K、Na、Ca、Mg、Mn、Fe、Al、P、S、Cu和Zn。常明昌等［7］對塊菌的鐵、鋅含量進行測定，結(jié)果顯示其含量是一般水果的8～10倍。

塊菌不僅含有豐富的營養(yǎng)成分，有關(guān)其生理活性方面的研究也引人關(guān)注。

1 塊菌的生理活性

1.1 抗病原微生物活性

塊菌的抗病原性是研究最多的生理活性，塊菌提取物對革蘭氏陽性、陰性的病原菌均有抑制作用。研究表明塊菌Terfezia和Tirmania pinoyi的提取物對革蘭氏陽性菌包括枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抗菌活性［8－9］。T.Claveryi提取物對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌具有明顯的抗菌活性。因提取溶劑的不同塊菌提取物的抗菌活性也有所不同。Hussan等［8］的研究表明，Tirmania塊菌的甲醇提取物相對于乙醇，水和乙酸乙酯提取物，具有更高的抗菌活性。Terfezia塊菌的乙醇提取物對于革蘭氏陽性菌和陰性菌具有廣泛的抗性。Janakat等［10－11］研究T.Claveryi的水和甲醇提取物的抗菌活性，結(jié)果顯示，5%水提取物的抑菌效率最高，能抑制66.4%的金黃色葡萄球菌生長;同時還發(fā)現(xiàn)T.Claveryi的5%水提取物可以抑制銅綠假單胞菌，抑制率為40.9%，然而甲醇提取物卻沒有抑制作用。說明塊菌中具有不同活性的抗菌活性物質(zhì)成分。

1.2 抗氧化活性

活性氧與人體衰老、腫瘤、突變、炎癥、心腦缺血、動脈粥樣硬化、帕金森病等許多病理生理現(xiàn)象具有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)在病理條件下，機體的抗氧化酶活性明顯下降，清除氧自由基的能力減弱，導(dǎo)致氧自由基增多，損傷作用加重，因此抗氧化食品的研究與開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義［12］。

多種塊菌不僅具有抗氧化能力，且其活性均比其它食用菌高［13］。Murcia等［14］對脂質(zhì)過氧化作用、脫氧核糖和過氧化物酶分析實驗的結(jié)果表明，塊菌T.claveryi Chatin和P.juniperi Vittadini比一些常用的抗氧化劑:α－維生素E，丁基羥基茴香醚(BHA)，2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚(BHT)和沒食子酸丙酯，具有更高的抗氧化活性，但是經(jīng)過冰凍和罐裝會導(dǎo)致新鮮塊菌的抗氧化能力下降。羅強等［15］從印度塊菌(Tuber indicum)子實體中提取出粗水溶性印度塊菌多糖(Tuber indicum polysaccharide，TIP)，之后成功的用DEAE52纖維素和Sephadex G－100柱層析進行分離純化，提取出兩種主要的多糖組分:TIP1－1和TIP2－1。TIP1－1和TIP2－1具有相當(dāng)強的抗氧化活性。TIP2－1對過氧化氫(300mmol/L)誘導(dǎo)的PC12細胞損傷有較好的抑制力，并且對自由基具有較強的清除能力。

在另一項研究中，Al－Laith［16］研究了分別來自于巴林島、伊朗、摩洛哥、沙特阿拉伯的四種沙漠塊菌的抗氧化能力。并對鐵還原能力(Ferric reducing ability，F(xiàn)RAP)、2，2－二 苯 基 －1－苦 肼 基(2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、抑制脫氧核糖損傷能力與一氧化氮(NO)自由基清除能力這四種抗氧化能力進行了檢測。結(jié)果顯示伊朗塊菌具有最高的DPPH(36.6%±13%)，最強的NO自由基清除能力(EC50=102mg/mL)，最高的脫氧核糖破裂抑制比例(91%)。巴林島和沙特阿拉伯塊菌顯示出最高的 FRAP值(分別為 18.62、18.06mmol/100g)。每100g以上塊菌中維生素C、胡蘿卜素、酯化多酚、自由和非黃酮多酚、黃酮含量的平均值分別為(681±245)、(10±51)、(1860± 361)、(1328±167)、(1034±124)、(293±32)mg。在所有樣品中，巴林島塊菌的維生素C含量最高，伊朗塊菌的胡蘿卜素含量最高，巴林島和沙特阿拉伯塊菌的自由多酚含量最高，沙特阿拉伯塊菌的花青素含量最高(23.6mg/100g)，可能是這些化學(xué)物質(zhì)使得塊菌具有抗菌活性。

Janakat等［17］研究了來自伊拉克巴格達的沙漠塊菌(T.claveryi)的保肝作用，用白鼠做實驗，測定不同T.Claveryi溶劑提取物(水，甲醇，石油醚)對于肝毒素CCl4的抵抗能力。在這項實驗中，首先分別用不同的T.Claveryi溶劑提取物喂養(yǎng)白鼠，之后用肝毒素(CCl4和橄欖油混合物)進行腹腔注射。結(jié)果顯示，T.Claveryi的水提取物具有最好的保肝性，其它兩種溶劑(甲醇，石油醚)提取物也具有不同程度的保肝性。肝毒素CCl4能夠引發(fā)機體產(chǎn)生自由基代謝絮亂，從而引起脂質(zhì)過氧化物積累等一系列反應(yīng)，進而促使肝細胞的凋亡或者直接死亡。塊菌中含有豐富的抗氧化成分，例如維生素A、C、β－胡羅卜素和酚類化合物等，能夠強烈清除自由基，從而抵抗CCl4對肝造成的損傷。

1.3 抗誘變活性

Hannan等［18］研究了Tirmania pinoyi的三種溶劑(水、三氯甲烷、乙醇)提取物的抗誘變能力，結(jié)果表明，Tirmania pinoyi的乙醇提取物能夠抑制苯并芘對沙門氏菌TA98和TA100產(chǎn)生的誘變。

Fratianni等［19］研究了產(chǎn)自意大利的黑色塊菌T.aestivum的抗誘變能力，這個團隊通過艾姆斯氏實驗來研究新鮮及經(jīng)過輻射處理(60Coγ射線，輻射劑量為1.5kGy)的T.Aestivum的潛在抗誘變能力。他們發(fā)現(xiàn)無論是新鮮的塊菌還是經(jīng)過輻射的塊菌，它們的水提取物和乙醇提取物都提高了細菌的抗誘變能力。相對于經(jīng)過輻射的塊菌，新鮮塊菌的水提取物對沙門氏菌TA98的誘變抑制能力更強。而塊菌無論是否經(jīng)過輻射，其乙醇提取物抗誘變能力都要比水提取物低。結(jié)果表明T.aestivum可能含有能夠抑制誘變產(chǎn)物形成的物質(zhì)，但是相關(guān)抑制物質(zhì)的分離鑒定及作用機制仍需進一步研究。

1.4 抗癌活性

胡惠娟等［20］研究了中國塊菌多糖(polysaccharide of Tuber sinense，PST)對小鼠腫瘤及免疫系統(tǒng)的影響，實驗結(jié)果表明PST(一種從中國塊菌中提取出來的蛋白結(jié)合多糖)作為一種新的真菌多糖，毒性低，水溶性好，抑制腫瘤作用明顯。

另外，Stanikunaite等［21］用包括塊菌在內(nèi)的22種來自北美的真菌，進行了生理活性的研究。這些真菌除具有不同程度的抗痢疾、抗結(jié)核、抗炎癥的抗病原微生物的活性外，還具有抗氧化活性、抗癌活性。其中G.clausa和R.subgelatinosus兩種塊菌表現(xiàn)出明顯的抗癌活性。

1.5 調(diào)節(jié)女性月經(jīng)周期和性功能

人們通常用母豬或者經(jīng)過訓(xùn)練的狗來尋找地下塊菌。1981年，Claus等［22］從黑松露中鑒定出一種甾族激素——α－雄烷醇，因其具有獨特的麝香氣味，從而推斷正是塊菌中的這種物質(zhì)可以吸引母豬。α－雄烷醇早在1951年就從女性的尿液中檢測出來，其香味濃厚，并具有一定的催欲作用［23］。α－雄烷醇也在男性的腋下汗液中檢測出來，但是缺乏雄性激素活性。用放射免疫檢定法和氣質(zhì)聯(lián)譜檢測新鮮塊菌中α－雄烷醇的含量，測定結(jié)果顯示每克新鮮塊菌含有40～60ngα－雄烷醇［21］。研究表明α－雄烷醇具有調(diào)節(jié)女性月經(jīng)周期、引起女性興奮的功能。α－雄烷醇很容易被氧化成雄烯酮類物質(zhì)，從而使女性對男性產(chǎn)生負面的心理影響［24］。雖然α－雄烷醇是否具有類似于性激素作用還不能完全確定，但法國人已把該化合物加到男性香水中，且價格十分昂貴［25］。我國也有一些酒廠將新鮮塊菌切片，泡制含有α－雄烷醇的保健酒，廣受社會好評。

2 塊菌活性物質(zhì)生產(chǎn)的研究進展

塊菌由于其獨特的芳香和生理活性，備受美食界和國際社會的青睞，塊菌在我國云南、貴州、四川等地產(chǎn)量豐富，當(dāng)?shù)厝硕嘁詨K菌為材料進行泡酒、烹飪、曬干磨碎(作為佐料或藥材)。但由于生態(tài)環(huán)境的惡化和對于野生塊菌資源的大肆開采，野生塊菌的產(chǎn)量從上個世紀急劇下降［26］。在1993年之前，四川省的會東塊菌年產(chǎn)量超過20t，到2003年，年產(chǎn)量只有4～5t。Tuber.siense，T.himalayense和T.pseudoexcavatum已經(jīng)被列為“瀕臨滅絕的真菌品種”［27］。野生塊菌的生長條件要求嚴格，生長周期長，受氣候條件影響大，且容易受蟲害和人工采集損傷的影響，昂貴的價格、大量的市場需求和可觀經(jīng)濟效益更是難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。目前塊菌活性物質(zhì)的提取主要以野生塊菌的子實體為原材料，通過蒸餾萃取，超臨界萃取，固相微萃取等方法進行。

2.1 半人工模擬栽培

早在200年前，法國就開始嘗試塊菌的人工培養(yǎng)，到了20世紀70年代，地中海地區(qū)的國家開始通過果園來進行塊菌培養(yǎng)［28］。隨著菌根技術(shù)的不斷發(fā)展，人們將塊菌的子實體經(jīng)勻漿后制成孢子懸液，或者將塊菌的菌絲體接種在橡樹等幼苗根部，讓其形成帶有菌根的菌根化苗木，將這些幼苗在適合林地上栽種，幾年之后這片林地中便可長出塊菌。這種前期工作在人工條件下完成，后期在自然條件下完成的塊菌生活史被稱為半人工模擬栽培(Semiartificial simulate cultivation)［29］。我國臺灣省在1996年左右成功栽培出“臺灣塊菌”。2002～2003年，臺商與國內(nèi)企業(yè)聯(lián)合在貴州省創(chuàng)建的塊菌果園用印度塊菌子實體勻漿制成的孢子懸浮液接種馬尾松(Pinus massoniana)、云南松(P.yunnanensis)、槲櫟(Ouercus aliena)、青岡櫟(Cyc/oba/anopsisg/auca)等7種無菌幼苗，2008年12月，該果園收獲了國內(nèi)首批半人工栽培的塊菌［30］。昆明植物所劉培貴研究組成功地培育了國產(chǎn)印度塊菌(Tuber indicum)和華山松(Pinus armandii)、板栗(Castanea mollissima)的菌根幼苗，并且將接種成功的菌根苗移栽至塊菌種植園科技示范實驗基地［31］。雖然近些年，半人工模擬栽培技術(shù)在不同國家都取得了一定的成功，但塊菌產(chǎn)量依然供不應(yīng)求。主要是由于半人工模擬栽培技術(shù)培育出的果園塊菌子實體產(chǎn)量不穩(wěn)定，易受雜菌污染，且生長周期較野生塊菌并未縮短，一般需要6～9年，果園塊菌的生長受多種因素的影響，包括土壤特性，如pH和營養(yǎng)成分［32］、濕度和灌溉［33］、宿主植物的生理條件［34］、頂棚的光線和密度［35］、氣候條件［36］、物種競爭［37］、塊菌子實體上的微生物和生長在塊菌土表的植物［38－39］。這些復(fù)雜的因素相互影響造成了果園塊菌子實體產(chǎn)量的不均一性。因此，若以塊菌子實體為原料生產(chǎn)生理活性物質(zhì)仍存在生產(chǎn)成本高和原料供應(yīng)難等限制性因素。

2.2 菌絲體發(fā)酵法生產(chǎn)塊菌活性物質(zhì)

液體發(fā)酵法生產(chǎn)真菌有用代謝產(chǎn)物的優(yōu)勢在藥用領(lǐng)域得到了充分的驗證，它可以避免人工栽培過程中氣候、土壤、蟲害、人為等條件的影響。同時發(fā)酵培養(yǎng)具有可以通過篩選獲得高產(chǎn)菌種、容易控制培養(yǎng)條件、保證產(chǎn)物品質(zhì)、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。許多研究結(jié)果表明，很多高等真菌液體發(fā)酵的菌絲體多糖含量遠高于人工栽培的高等真菌。據(jù)報道，從液體發(fā)酵蜜環(huán)菌菌絲體中所提取的粗多糖約為人工栽培的10倍［40］。對靈芝發(fā)酵的研究也有類似的報道，靈芝中的主要生理活性物質(zhì)為靈芝酸和靈芝多糖，凌慶枝等通過優(yōu)化條件，胞外靈芝酸產(chǎn)量達到0.86g/L，比自然發(fā)酵工藝提高了34.4%;并提高了胞內(nèi)靈芝酸的產(chǎn)量，達到0.3649g/kg濕菌體［41］。

我國已經(jīng)有一些研究者開始利用塊菌菌絲體進行液體發(fā)酵生產(chǎn)活性物質(zhì)，并取得了進展，湯亞杰等［42］通過塊菌菌絲體深層發(fā)酵生產(chǎn)α－雄烷醇、塊菌多糖等生理活性物質(zhì)，測定每1mL發(fā)酵液中α－雄烷醇含量相當(dāng)于2g新鮮塊菌中α－雄烷醇的含量;還對接種量、碳源以及它們的初始濃度對于菌絲體生長和塊菌多糖產(chǎn)量的影響進行了研究，結(jié)果表明蔗糖最適合細胞生長及胞內(nèi)多糖(IPS)生產(chǎn)，乳糖最適合胞外多糖(EPS)生產(chǎn)。當(dāng)蔗糖濃度為125g/L時，生物量和EPS產(chǎn)量都達到了最高值，分別為(24.07± 1.94)g/L和(2.85±0.04)g/L;蔗糖濃度為80g/L時，IPS產(chǎn)量最高，為(2.92±0.20)g/L。最大的EPS在接種量最大653mg DW/L時獲得，為(1.97±0.08)g/L;最大的IPS為(1.40±0.10)g/L，在接種量為487mg DW/L時獲得［43］。在另一項研究中，湯亞杰通過建立響應(yīng)面模型研究氮源對塊菌細胞生長和塊菌多糖產(chǎn)量的影響，根據(jù)模型預(yù)測，葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨的最優(yōu)初始濃度分別為60、30、10g/L，驗證實驗表明實驗值與預(yù)測值相符合［44］;最后又進行連續(xù)發(fā)酵塊菌生產(chǎn)菌絲體和塊菌多糖，最大生物量、EPS和IPS的產(chǎn)量分別達到了(53.72±2.57)g DW/L，(7.09±0.62)g/L和(4.43±0.21)g/L［45］。這些研究表明，利用液體發(fā)酵生產(chǎn)塊菌活性物質(zhì)，具有成本低、易培養(yǎng)、周期短等優(yōu)勢，彌補了利用子實體生產(chǎn)塊菌活性物質(zhì)的不足，具有代替子實體用于生理活性物質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

3 結(jié)論

目前對于塊菌的研究多集中在真菌學(xué)、人工栽培和芳香成分分析等方面，并且由于塊菌生長周期長、來源稀少，使得塊菌生理活性物質(zhì)的開發(fā)具有很大的局限性。近幾年，液體發(fā)酵技術(shù)在塊菌上的運用，為塊菌生理活性物質(zhì)生成提供了一種更為高效率，低成本的方法。雖然塊菌通過不同溶劑提取的提取物生理活性得到了研究，但塊菌溶劑提取物中具有生理活性的單獨或復(fù)合成分仍未分離鑒定，活性物質(zhì)的具體化學(xué)組分研究存在不足。另外，不同塊菌的生物活性物質(zhì)的種類及含量具有差異，有針對性的篩選適合生產(chǎn)特定活性物質(zhì)的塊菌具有重要意義。

最近，黑孢塊菌的全基因組的測序已完成［46］，這也使得研究者們能夠從基因水平深入研究塊菌的生理活性，對塊菌特定活性物質(zhì)的合成途徑和主要功能基因進行解析。利用微生物代謝工程的原理，可以有針對性地對塊菌菌絲體進行代謝工程改造，高效生產(chǎn)α－雄烷醇、塊菌多糖等生理活性物質(zhì)。

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Main physiological activities of Truffles and research progress of active substances production

GUO Min，TANG Li－wei，YAN Jin－ping，CHAGAN Irbis*
(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)

Truffles belong to a family of fungi that grow underground in a symbiotic relationship with the higher plants.In taxonomy，they belong to tuber，tuberaceae，tuberales of ascomycetina.Truffles have a wide range of physiological activities，including oxidation resistance，anti－pathogenic microorganism activity，liver protection，resistance to mutagenesis，antitumor and regulation of menstrual cycle and sexual function in females，et al.In this review，the physiological activities of Truffles and research progress of obtaining active substances were introduced in detail.The problems existing in the current research of active substances in truffles were investigated and its development prospect was proposed.

Truffle;biological activity;active ingredient

TS201

A

1002－0306(2012)21－0403－05

2012－05－08 *通訊聯(lián)系人

過敏(1986－)，男，碩士研究生，從事塊菌的生理活性及活性物質(zhì)生產(chǎn)研究。