晚期肺腺癌外周血TS mRNA表達與培美曲塞治療療效的關系

孫 哲 ，余 鋒 ，衣玉麗 ，章 潔 ，汪小浪

（南昌大學a.第一附屬醫院腫瘤科；b.護理學院；c.醫學院生化教研室，南昌 330006）

在選用培美曲塞作為晚期肺腺癌患者的化療方案時先檢測患者外周血胸苷酸合成酶（TS）mRNA表達的情況來預測培美曲塞給患者帶來的益處，能更加有針對性的選用化療方案，從而進行個體化治療。檢測患者外周血TS mRNA的表達比檢測腫瘤組織中TS表達更方便易行。本文應用逆轉錄聚合酶反應技術（RT-PCR）檢測晚期肺腺癌患者化療前TS mRNA水平并分析其與培美曲塞治療療效的關系,以探討其在預測晚期肺腺癌化療療效方面的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇 2009年 6月至 2011年12月在南昌大學第一附屬醫院就診的Ⅲ、Ⅳ期晚期肺腺癌患者29例。納入標準:年齡＜70歲；體力狀況（ECOG）評分＜2分；經組織病理學確診為腺癌；根據UICC肺癌分期標準為Ⅲ期或Ⅳ期；未接受過手術、放化療和靶向治療;有可測量病灶；肝腎功能正常，無化療禁忌，且預計生存期大于3個月；取得患者及家屬同意。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol（Invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒（Qiagen公司），PCR擴增試劑盒（上海生工），引物由primer premier5.0軟件系統設計，TS引物序列:5’2 CTTCAGCGAGAACCCAGACC23’，5’2 TCCAGCCCAACCCCTAAAGAC23’，PCR 產物長度192 bp。

1.3 化療方案

培美曲塞 500 mg·m-2靜脈點滴，第1天;順鉑75 mg·m-2靜脈點滴，第1天。21 d為1周期。用藥前 24 h口服地塞米松 4 mg，2次·d-1，連服 3 d；用藥前1周給予VitB121000 μg單次肌內注射，并予葉酸 400 μg，1 次·d-1，連服至培美曲塞結束后 21 d。

1.4 療效評價

化療2周期后按RECIST1.1實體瘤療效評價標準評價療效。有效組為完全緩解（CR）和部分緩解（PR），無效組為穩定（SD）和疾病進展者（PD）。

1.5 外周血TS mRNA表達檢測

采用RT-PCR檢測患者化療前外周血中TS mRNA的表達水平。對所有的肺癌患者于治療前抽取外周靜脈血5 mL,EDTA抗凝。用淋巴細胞分離液分離出白細胞。按照Trizol Reagent說明提取外周血的總RNA，-70℃保存，備用。RNA-cDNA特異序列逆轉錄:30 ℃ 10 min，42 ℃ 35 min，99 ℃ 5 min，4℃5 min；瞬間離心5～10 s。PCR特異序列擴增:PCR 反應體系 25 μL，其中 cDNA 2 μL，10×PCR 緩沖液 4 μL，TaqDNA 聚合酶（1 U·μL-1）1 μL，4 種dNTP 混合物（2 mmol·L-1）2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，上下游引物各 0.04 μL，用無 RNA 酶去離子水定容至25 μL。以三磷酸甘油醛脫氫酶（glycer-aldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH）為內對照，與目的基因同管擴增。反應條件:94℃預變性3 min后，進行 35 個循環（94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s），4℃冷卻，同時cDNA在同一反應條件下，用GAPDH上下游內引物各10 μL，同樣條件30個循環，最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物分析:用1.5%的瓊脂糖凝膠，厚度約4 mm，上樣擴增產物 10 μL，每 cm 電壓為 80 V，電泳 30 min，在SZD700凝膠成像系統下攝像分析。并計算目的片段的灰度，分別與其內參GAPDH的灰度作比較分析（TS/GAPDH）。

1.6 統計學方法

2 結果

化療2周期后，根據化療療效分組，29例中有效組 7例（CR 1例，PR 6例），無效組 22例（SD 16例，PD 6例）。有效組外周血 TS mRNA的表達為0.66±0.12，無效組為 1.23±0.21，有效組明顯低于無效組，2組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

培美曲塞（pemetrexed，MTA，LY231514）是基于經典的抗代謝類藥物甲氨蝶呤和氟尿嘧啶基礎上研制的新一代抗代謝藥，由禮來公司（EliLily，Inc）研發。除FDA批準的適應證:惡性胸膜間皮瘤和非小細胞肺癌外，培美曲塞單藥或聯合化療對多種腫瘤有明顯的治療作用。培美曲塞能夠通過干擾葉酸代謝和DNA的合成來抑制腫瘤生長。培美曲塞的作用靶點在于嘧啶和嘌呤合成過程中的多種酶。其中之一是作用于TS，此作用與氟尿嘧啶（FU）類似，TS是胸苷酸合成中的限速酶，在DNA合成中充當著關鍵作用，由于對TS的抑制，故DNA合成所必須的可利用的胸腺嘧啶減少，接著就造成細胞增殖下降，特別是在快速增殖的腫瘤細胞［1］。

有4項培美曲塞與鉑類藥物聯合一線治療晚期NSCLC的Ⅱ期臨床研究［2-5］結果表明，培美曲塞與鉑類聯合方案的療效與其他常用的含鉑兩藥聯合方案相似，而毒性反應的發生率則明顯較低。

化療在癌癥的治療中占重要地位，然而化療并非對所有的癌癥患者都有效，如何使癌癥化療更具針對性、有效性、減少盲目性，已成為當前研究的熱點。有很多研究證明肺腺癌中TS呈顯著的高表達［6］，TS對肺癌的預后同樣非常有意義。非小細胞肺癌的惡性程度也同TS的高表達有關［7-8］。既往研究表明，腫瘤內TS水平的高低能夠預測TS相關治療的療效［9］。那么外周血TS mRNA的表達水平能不能預測培美曲塞的療效？本研究的結果顯示:臨床有效（CR+PR）的患者外周血TS mRNA表達水平低于穩定（SD）和疾病進展（PD）的患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。因此，晚期肺腺癌外周血中TS轉錄水平對培美曲塞治療療效的預測有一定的價值。

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