高純度水飛薊賓相關雜質研究

武俊明 陸繼好

水飛薊素(Silmyarin)是指從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取所得的一種黃酮木脂素類化合物。主要的活性成分有水飛薊賓(Silybin)、異水飛薊賓(Isosilybin)、水飛薊亭(Silychristin)和水飛薊寧(Silydianin)等四種同分異構體，水飛薊用來治療肝膽疾病已有2000多年的歷史，被稱為“天然的保肝藥”，本文采用三已知對照品進行了雜質檢查方法可行性的初步驗證，采用雜質對照品進一步驗證方法對已知雜質檢測的可行性。并對雜質對照品進行了必要的結構確證資料。

一、儀器和試劑

BRUKER AV500型核磁共振儀

儀器：PU－1580液相色譜儀(日本Jasco公司)

UV－1575紫外檢測器(日本Jasco公司)

N－2000雙通道色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究所)。

樣品來源：江蘇中興制藥有限公司

樣品批號：20110501 20110502 20110503

水飛薊賓對照品批號：20070201含量：99.97%

二、已知雜質研究

1.三個已知雜質對照品核磁共振譜的確定

根據文獻，水飛薊賓有三種主要有關物質，分別為水飛薊亭、水飛薊寧、異水飛薊賓(A+B)，實驗結果表明，除去DMSO－d6溶劑峰(δ2.50，7重峰)、精制樣品時所用溶劑峰(δ3.29)和雜質峰，三個物質的氫譜歸屬結合了水飛薊賓的氫譜歸屬，各個物質H的歸屬結果三個物質歸屬結果和文獻相一致，從上可以證明三個雜質分別為水飛薊亭、水飛薊寧和異水飛薊賓(A+B)。

2.已知雜質檢測的專屬性試驗

色 譜 柱：Shimpak CLC －ODS 15cm ×6.0mm，5um

流動相：甲醇∶水∶冰醋酸=41∶59∶5

檢測波長：288nm

流量：1.0ml/min

進樣量：20μl

柱溫：30℃

分別精密稱取異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭對照品適量，加甲醇超聲使溶解，并稀釋制成約40ug/ml的溶液，另取水飛薊賓適量加甲醇超聲使溶解，并稀釋制成1mg/ml的供試液。分別精密量取異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭溶液各1ml，置于10ml容量瓶中，加入水飛薊賓供試液稀釋定容至刻度，搖勻，制成混合溶液，進樣20μl。

由結果可知：按照本品的有關物質方法均能有效地檢測出異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭已知雜質，兩峰之間的分離度為1.642，與前后峰的分離度分別為1.990和2.004，理論塔板數為4766。按照本品的有關物質方法考察異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭等雜質的分離檢出情況良好，符合規定。

三、自制樣品和上市原料有關物質的比較

取本品適量(約相當于水飛薊賓25mg)，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超聲20分鐘，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液;精密量取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄供試品溶液色譜圖至主成分峰保留時間的2倍，測定波長為288nm，三批樣品、上市藥品及中檢所對照品的按面積歸一化法計算有關物質，結果見表1。

表1 有關物質檢查結果

未知雜質B 0.02 0.02 0.03 0.03 0.14未知雜質C 0.02 0.04 0.03 0.02 0.07未知雜質D / / 0.03 / /未知雜質E 0.18 0.17 0.12 0.23 0.23未知雜質F / / / 0.04 /水飛薊亭 / / / / /水飛薊寧 / / / / /異水飛薊賓 0.23 0.26 0.29 0.14 0.22總雜質0.45 0.51 0.50 0.47 0.66

結論：參照《化學藥物雜質研究的技術指導原則》本品最大日劑量為420mg(≤2g)，故本品報告限0.05%，鑒定限0.10%，質控限0.15%。其中未知雜質E和已知雜質異水飛薊賓大于鑒定限和質控限，未知雜質E含量明顯低于已上市產品雜質實測值;已知雜質異水飛薊賓是水分薊素中主要有效成分之一，見文獻。

四、討論

在水飛薊素中水飛薊賓含量最高，活性也最高。常鳳崗等研究了我國引種的水飛薊化學成分，得到兩個單體，并與國外的栽培品種進行了比較鑒定為水飛薊賓和水飛薊寧。

本文對已知雜質數量文獻檢索和核磁共振譜結構確證研究，采用雜質對照品進一步驗證方法對已知雜質檢測的可行性。參照《化學藥物雜質研究的技術指導原則》和上市原料藥有關物質進行對比分析，對含量大于鑒定限和質控限但小于上市原料的未知雜質E進行質譜分析和DAT全波長分析，確定為同一雜質。

1 定天明、田頌九、張正行、谷道昭、施蘊華、孫曾培等.水飛薊素制劑中有效成分HPLC分離測定［J］.藥物分析雜志，1999，19(3)：304－307.

2 苑輝卿等.水飛薊素近期研究，國外醫學.中醫中藥分冊1996，18(1)：3－5.

3 朱鉉等.水飛薊素制劑的研究進展，中國野生植物資源，2001，20(3)：47－49.

4 吳知行等.水飛薊賓及其水溶性衍生物和制劑含量測定方法的研究 南京藥學院學報，1981，12(2)：28－36.