百里香染色體制片優化及核型分析

楊寧，談永霞，2，李巧峽，賈凌云，陳錫蓮，劉效瑞

（1.西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州730070；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730070；3.定西市旱作農業科研推廣中心，甘肅 定西743000）

百里香（Thymus mongolicus），又名地姜、地椒、麝香草，為唇形科百里香屬植物。百里香的株型奇特低矮，花型小，花色艷麗，且全株芳香，喜涼爽氣候，喜光，稍耐蔭，耐寒耐旱，忌濕，耐貧瘠［1］。百里香屬植物原產于地中海沿岸，全球約有400多個種，廣泛分布在北非、歐洲和亞洲溫帶地區，經濟栽培以南歐最多［2］。我國有11種，2個變種，分布于甘肅、新疆、青海、西藏及黃河流域及以北地區［3］。百里香屬植物具有分布廣泛、適應性強、種內多型性較為普遍等特點，在溫帶干旱半干旱地區的荒漠化生境的植物群落組成及生態演替中發揮著重要的生態功能［4，5］。作為一種頗具開發價值的多用途植物，近年來，百里香作為芳香蔬菜、藥用植物、香料作物、蜜源植物、觀賞植被及干旱土壤的水土保持植物被大面積種植［6］。

形態學分類方法是最基本的植物分類方法，在植物分類研究中一直沿用。但是由于百里香屬植物不同種之間的形態差異較小，加之近年來國外品種的大量引進，所以，僅以形態學方法難以提供可靠的分類依據，亟需采用多種方法來加強百里香屬植物的分類研究［1］。隨著分子生物學技術的發展，分子標記及基因序列的分析方法已被廣泛應用于物種的親緣關系、遺傳變異及系統演化的研究。由于分子的研究方法是基于染色體上的一段DNA序列，因此其結果有時不如用染色體組分析法直觀［7］。染色體核型分析技術能明確識別各個染色體的特征，有助于基因定位的研究，它是細胞遺傳學的一項基本技術，也是染色體工程、細胞分類學和植物育種學的一個不可缺少的手段。對染色體進行核型分析，不僅有助于了解生物的遺傳組成、遺傳變異規律和發育機制，而且對預測鑒定種間雜交和多倍體育種的結果、了解性別遺傳機理以及基因組數、物種起源、進化和種族關系的鑒定都具有重要的參考價值［8，9］。通過對細胞核染色體核型穩定特征（染色體的數目、相對長度、著絲點位置、核型不對稱系數和隨體的有無等）的分析，可以作為分類指標而被利用。因此，染色體核型分析技術可為研究生物的系統發育和親緣關系提供依據［10］。

由于百里香屬植物的染色體非常小，為1～2μm，一般較難觀察，所以國內外對百里香屬植物染色體數目、核型分析的研究的相關報道極少，國內僅見權俊萍等［11］對我國產4種2個變種百里香屬植物進行了染色體數目及核型分析研究，國外對百里香屬植物的研究較為廣泛和深入，并依據形態學差異及地理分布特點等將其分為Micantes，Mastichina，Piperella，Teucrioides，Pseudothymbra，Thymus，Hyphodromi和Serpyllum 等8個組，其中分布于亞洲的種多存在Hyphodromi和Serpyllum組中［12］。然而對我國百里香屬植物染色體的數目、核型分析方面的特征、染色體數目在種（變種）間的差異及其在百里香屬所在組等方面的基礎植物學問題仍有許多不清楚。筆者首次對甘肅康樂城郊百里香染色體制片技術進行了優化并對其染色體進行了核型分析，旨在積累其細胞學資料，以期為甘肅地產野生百里香的系統分類、遺傳進化及遺傳育種提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采自甘肅康樂縣城郊百里香種子，挑選粒大飽滿的百里香種子放在墊有雙層濕潤濾紙的培養皿中，于2009年11月置于25℃恒溫培養箱中萌發。

1.2 方法

百里香幼苗芽尖為材料，選取上午8：00－10：00，每隔15min取材1次，用0.02%秋水仙素處理3h，以確定適宜的取材時間；以0.01%～0.04%秋水仙素附加8－羥基喹啉溶液作為預處理液，處理2～4h，以確定適宜的預處理液，預處理液及處理時間見表1。取預處理后的材料，漂洗2～3次，置于卡諾固定液室溫下固定24h之后，用超純水漂洗固定的材料2～3次，于0.1mol／L HCl中，60℃水浴鍋內恒溫分別解離5～25min，確定最適宜的解離時間；45%冰醋酸軟化10min后用清水沖洗3～4次，切取百里香芽尖生長點部分，置于載玻片中央，濾紙吸去多余液體，改良石炭酸品紅染色液分別染色10～80min，常規方法壓片［13］，之后鏡檢，對分散較好的染色體裝片在100倍顯微鏡及圖像分析系統下鏡檢并拍照。

表1 預處理液及處理時間Table 1 Reagent and time for pretreatments

核型分析采用李懋學等［14，15］提出的標準進行；根據Levan等［16］的命名法則，來確定染色體的著絲點位置；染色體核型分類按照Stebbins［17］提出的根據最長與最短染色體的比值和臂比值，來區分核型對稱和不對稱程度；染色體相對長度指數（I.R.L）參考 Kuo［18］提出的方法計算；核型不對稱系數（As.K）參考 Arano［19］的方法計算。相關公式為：

2 結果與分析

2.1 制片

圖1 不同取材時間內百里香中期細胞的百分比Fig.1 The percentage of the division cells in mitosis metaphase at different sampling times

上午8：45－9：15是觀察百里香染色體數目比較好的時期，中期細胞的百分比最高可以達到40%（圖1），其他取樣時間雖然也可以觀察到中期分裂相的細胞，但所占比例較小，不易篩選出分散較好的染色體分裂相。以0.04%秋水仙素和0.002mol／L 8－羥基喹啉等體積混合溶液預處理百里香芽尖2～3h，既發揮了秋水仙素累積分裂中期相的高效性，又保持了8－羥基喹啉能使染色體清晰，便于觀察的特點（表2）。另外，在60℃，0.1mol／L HCl中解離15min，后用45%冰醋酸軟化10min效果最佳；酸解5及10min由于細胞解離不充分，細胞不易分散，造成許多細胞重疊在一起，內部細胞由于接觸不到染液而染色較淺，外部細胞卻由于細胞質也著色，對比度低，染色體不容易觀察；酸解20及25min雖然解離比較充分，細胞容易分散，細胞質也不易著色，但細胞中的染色體染色太淺而不易觀察，部分細胞由于解離過度而出現破裂，染色體也出現不同程度的破壞，斷裂成片段，影響染色體數目統計和核型分析（表3）。

2.2 核型分析

2.2.1 染色體數目 選擇30個染色體分散良好的細胞觀察計數，其中26個細胞染色體數目為24條，占計數總數的86.7%；4個細胞染色體數目為26，占計數總數的13.3%。根據核型分析標準化建議［16］，確定百里香染色體數目為2n＝2x＝24。

2.2.2 染色體相對長度及核型分析 根據李懋學和陳瑞陽［14］提出的植物核型分析標準，進行百里香染色體核型分析。選擇30個百里香細胞進行染色體計數，核型取5個細胞的平均值。測量染色體長臂和短臂，計算染色體相對長度、臂比值、染色體相對長度指數，按照染色體總長度由長至短的順序對染色體進行排列和編號（表4，圖2～4）。

實驗結果可以得出百里香染色體的數目為2n＝2x＝24，其中第2號和第7號為近中部著絲粒染色體（sm），其余均為中部著絲粒染色體（m）；由長染色體（L）、中長染色體（M2）、中短染色體（M1）和短染色體（S）4種染色體組成。核型公式為2n＝2x＝24＝20m＋4sm，核染色體相對長度在7.07%～13.13%，染色體長度比為1.86，染色體臂比大于2∶1的染色體占8.33%，按照Stebbins［17］的核型分類標準，百里香的核型屬2A型，核型不對稱系數為59.63%。

表2 不同預處理液的效果比較Table 2 Effects of different reagent for pretreatment

表3 不同解離時間的效果比較Table 3 Effect of different dissociation time

表4 百里香染色體的核型參數Table 4 Karyotype parameters of chromosome in T.mongolicus

圖2 百里香染色體形態Fig.2 The chromosome morphology of T.mongolicus

圖3 百里香染色體的核型圖Fig.3 Karyotype of chromosome in T.mongolicus

3 討論

3.1 百里香染色體制片技術的探究

根據李懋學等［14，15］提出的植物核型分析標準，確定百里香的染色體屬于小染色體，這給百里香染色體數目的統計和核型分析帶來很大困難。取材部位、取材時間、預處理液的種類和濃度、預處理時間、酸解的時間及方法、染色時間等都影響實驗的成敗。理論上講，任何時間取樣壓片，都可以從正常生長的根中獲得中期分裂相［20，21］。但是如果分裂相所占的比例很小，核型分析就十分困難。李國珍［22］認為，一般植物細胞染色體的分裂高峰期在上午的8：00－10：00，而董然等［23］在對長白山3種橐吾（Ligulariasibirica）的核型研究中，取材時間為上午10：00，趙振軍［24］在阿拉伯茶（Cathaedulis）細胞的研究中得出細胞集中分裂時間在上午8：30－11：30，閻素麗［25］在對向日葵（Helianthusannus）的核型分析中發現上午9：30－10：00是取材的最佳時間，而本實驗初步觀察到百里香在上午8：45－9：15間存在分裂高峰期，將近40%的細胞處于分裂中期，有利于篩選分散良好的百里香染色體用于核型分析。

在染色體制片中對材料進行預處理主要是阻斷紡錘體的形成，使細胞分裂終止在中期階段，可提高中期分裂相的出現頻率。由于植物不同物種之間的差異性，不同植物所適合的預處理液一般不同。張永兵等［26］在對甜瓜（Cucumismelo）的核型分析中用對二氯苯和紡線菌酮的混合液預處理甜瓜根尖，獲得了主、次縊痕清晰、分散良好的中期染色體分裂相，張紅梅等［27］在青花菜（Brassicaoleracea）染色體核型分析中得出用0.002mol／L 8－羥基喹啉處理2.5h染色體分散性最好。本實驗確定在百里香染色體制片中以0.04%秋水仙素和0.002mol／L 8－羥基喹啉等體積混合溶液預處理百里香芽尖2～3h，秋水仙素累積分裂中期相最多，結合8－羥基喹啉又能使染色體更清晰、便于觀察。

圖4 百里香染色體的核型模式圖Fig.4 Karyotype pattern of chromosome in T.mongolicus

3.2 百里香的遺傳分類學探討

國外對百里香屬內各組部分種的研究結果表明，Micantes組染色體為二倍體，染色體數目為30，Mastichina組的染色體為二倍體和四倍體，染色體數目有30，58，60，染色體基數多為15或15的倍數；Piperella組的染色體為二倍體，基數為14；Pseudothymbra組的染色體包括有二倍體和四倍體，染色體數目包括28，30，56，染色體基數為14，15或相應的倍數；Thymus組的染色體比較復雜，染色體數目包括有28，30，54，56，58，基數多為14，15，27，28，29；Hyphodromi組染色體數目有26，28，42，54，56，58，60，62，84，90，染色體基數包括13，14，21及它們的倍數等等；Serpyllum組同 Hyphodromi組較相似，染色體數目有24，26，28，30，32，35，52，56，58，84，90，染色體基數包括12，13，14，21等［11，28］。本實驗結果表明，甘肅康樂地產野生百里香的染色體為2倍體：2n＝2x，染色體基數為12，對比國外報道的百里香屬各組的染色體數目資料，初步比較發現產自甘肅康樂縣的百里香染色體數目及形態特征與百里香屬內的Serpyllum組在染色體基數及數目方面較為相似。一般認為，核型進化的基本趨勢是由對稱向不對稱發展的，系統演化上處于比較古老或原始的植物，大多具有較對稱的核型，而不對稱的核型則常見于衍生的、特化的以及比較進化的植物類群中［15］。核型不對稱系數越接近50%，核型的對稱程度越高，進化程度越原始，對甘肅地產百里香核型不對稱系數和核型類型分析，百里香的核型不對稱系數為59.63%，接近于50%，具有較大的對稱性；其核型屬2A型，表明甘肅地產百里香在百里香屬中是相對較為原始的。而權俊萍等［11］對我國4種、2個亞種百里香屬植物的研究結果中表明，除百里香種未確定外，其他3種及2個亞種的核型均為2B，說明它們在百里香屬中是比較進化的，這與對甘肅康樂縣地產百里香核型的研究結果有一定的差異，推測甘肅康樂地產百里香在百里香屬中是比較原始，不能歸屬于上述3種。關于其在百里香屬內的系統地位問題，還需進一步研究，才能作出準確判斷。

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