農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷種子萌發及幼苗生長發育的影響

徐開杰，燕明獻，柴乖強，孫風麗，劉曙東，奚亞軍

（西北農林科技大學農學院，陜西 楊凌712100）

柳枝稷（Panicum virgatum），屬于禾本科（Gramineae）黍屬（Panicum），是起源于北美洛基山脈以東、北緯55°以南大草原的高稈多年生草本C4植物，通常被用于放牧、水土保持以及生態建設等［1，2］。近幾年來隨著社會的發展，人類對能源的需求日益劇增，而全球化石原料的不可再生性以及其對環境造成的嚴重污染，使尋找一種新的可再生清潔能源成為世界各國研究的當務之急。柳枝稷因其適應性強，生物量潛力高和耐旱耐貧瘠能力較強，對環境友好，能夠用于生產生物能源等優點引起了國內外的重視［3－5］。

隨著分子生物學的發展，農桿菌介導法已成為一種最常用的植物遺傳轉化方法，在植物遺傳改良方面展示出廣闊地應用前景，在多數雙子葉植物和少數單子葉植物中實現了較為高效的轉化［6－8］。與其他轉化方法相比，農桿菌介導的遺傳轉化系統具有轉化的外源DNA結構完整、遺傳穩定、拷貝數低、轉化的DNA片段較大等優點，已成為目前大多數植物遺傳轉化的首選方法［9－12］。

柳枝稷的遺傳轉化研究起步較晚，迄今為止國內外對柳枝稷農桿菌轉基因研究尚處于體系建立的探索階段［13－16］。農桿菌常規介導法對組織培養技術依賴性強，對組織培養條件要求嚴格，農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）浸染過的愈傷組織在培養過程中受剩余農桿菌難以抑制、抗生素篩選等因素的影響而長勢較弱、缺乏生長點甚至大量死亡等特殊問題，使得傳統的農桿菌介導法在柳枝稷上受到了一定限制。

農桿菌浸種法是將萌動種子直接浸泡在農桿菌菌液中，利用農桿菌的浸染特性和植物細胞自身的物質轉運系統把外源基因導入受體細胞并整合到基因組中穩定表達，通過種子天然的遺傳傳遞能力，實現遺傳轉化［17］。這種方法操作簡單，避免了常規介導法存在的一系列弊端。1987年，Feldmann和Marks［18］首次報道應用農桿菌浸種法在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中取得成功，繼而應用該法在小麥（Triticum aestivum）、黃瓜（Cucumis sativus）和番茄（Solanum lycopersicum）等作物中也取得成功［17，19－21］。

本試驗以‘西稷1號’、‘西稷2號’和‘西稷3號’3個基因型的柳枝稷種子作為研究對象，通過分析農桿菌浸種后柳枝稷種子萌發和幼苗生長發育的相關指標，確定不同濃度農桿菌對柳枝稷種子萌發和幼苗生長發育的影響，以期為柳枝稷農桿菌浸種法遺傳轉化體系的建立提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以西北農林科技大學小麥和柳枝稷分子育種實驗室選育的3個柳枝稷品系‘西稷1號’、‘西稷2號’和‘西稷3號’為試驗材料，農桿菌菌株為本實驗室提供的EHA105，試驗于2011年4－6月在西北農林科技大學溫室進行。

1.2 方法

1.2.1 種子預處理 取成熟飽滿的柳枝稷種子，70%的酒精表面消毒，用20%的NaClO滅菌15～20min，無菌水沖洗3～4次，室溫無菌水浸種12h，4℃過夜，然后濾干水分24℃暗培養至種子露白。

1.2.2 農桿菌準備 用LB（Luria－Bertani）固體培養基劃線接種農桿菌，28℃靜置暗培養2～3d。刮出單菌落接入LB液體培養基中，28℃、220r／min振蕩培養24h，分光光度計（725N，上海棱光）在波長為600nm的吸光度測定菌液OD600值。

1.2.3 農桿菌浸種 試驗采用裂區設計，以柳枝稷不同品系為主區，農桿菌菌液濃度為副區。其中農桿菌菌液濃度梯度設置為CK（以未加農桿菌的LB培養基為對照），0.4，0.8，1.2和1.6OD600共5個水平，將預處理露白的柳枝稷種子利用農桿菌浸種4h后倒掉菌液，用無菌水沖洗干凈，于24℃黑暗條件下共培養2d，然后轉入光照條件下，1周后待幼苗根長2cm左右，轉移到溫室盆栽，取大田土過篩裝盆，每盆12株，試驗溫室盆栽管理條件是在25℃，光照強度12 000lx，光照時間14h／d，每隔3d澆1次水，7d施1次肥，試驗重復3次。

1.2.4 測定項目與方法 農桿菌浸種后第7天測定發芽率（盆栽前），盆栽第3周幼苗三葉期取其葉片測定其余指標。

幼苗總葉綠素含量用丙酮法測量［22］；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量具體參照孫群和胡景江［23］的方法測定，每指標均重復測定3次。

1.3 數據處理

采用DPS裂區設計中的LSD檢驗進行統計分析，用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷種子發芽率的影響

農桿菌對柳枝稷不同品系發芽率的影響大致相同。在菌液濃度≤1.2OD600時，種子發芽率隨菌液濃度的增大呈下降趨勢，在1.2OD600時，發芽率達到最低值，此后略有升高（圖1）。方差分析表明，品系與濃度間的互作效應不顯著。品系間西稷1號與西稷3號的發芽率差異不顯著，而兩者極顯著高于西稷2號（P＜0.01）。在一定菌液濃度范圍內（≤1.2OD600），柳枝稷種子發芽率隨著農桿菌菌液濃度增加而顯著降低，各處理與對照間差異均達到極顯著水平（P＜0.01）。但當菌液濃度高于1.2OD600后，柳枝稷種子發芽率不再降低，且有一定程度回升。

2.2 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗成苗率的影響

農桿菌浸種不僅能抑制種子的萌發，也影響柳枝稷幼苗的成苗率（圖2）。柳枝稷幼苗的成苗率隨著菌液濃度的升高總體呈下降趨勢。在農桿菌菌液濃度較低時，成苗率較高，當菌液濃度為1.6OD600時，3個材料的幼苗成苗率均達到或接近最小值，分別為22.73%，18.01%和42.15%，其成苗率均低于50%。方差分析表明，品系與濃度間互作效應不顯著。品系間表現為西稷3號＞西稷1號＞西稷2號，各品系間差異均達極顯著水平（P＜0.01）。在菌液濃度≤0.8OD600時，幼苗成苗率呈下降趨勢，且各處理間的幼苗成苗率差異極顯著（P＜0.01）；菌液濃度在0.8～1.2OD600時，幼苗成苗率又極顯著升高（P＜0.01）；此后幼苗成苗率極顯著下降（P＜0.01），除西稷3號0.8和1.6OD600處理差異不顯著外，其余各處理間差異均達極顯著水平，說明農桿菌菌液濃度過高對柳枝稷幼苗有毒害作用。

圖1 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷種子發芽率的影響Fig.1 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seed germination rate of P.virgatum

圖2 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗成苗率的影響Fig.2 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings rate of P.virgatum

2.3 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響

農桿菌對柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響是隨菌液濃度的升高幼苗葉綠素含量呈極顯著下降趨勢（P＜0.01）（圖3）。經方差分析，品系與濃度間互作效應不顯著。品系間西稷3號顯著高于西稷1號（P＜0.05），極顯著高于西稷2號（P＜0.01），而西稷1號與2號差異不顯著。農桿菌對柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響隨濃度的升高明顯增大，不同菌液濃度處理與對照間差異均達極顯著水平（P＜0.01），這表明農桿菌對幼苗葉綠素的合成具有不利影響，且影響隨菌液濃度的增大而增大。

2.4 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗SOD活性的影響

當植物處于逆境條件下，一方面使活性氧產生加快，另一方面植物本身會促使以超氧化物歧化酶（SOD）為主的保護系統的酶活性升高，以減少細胞膜系統及生物大分子受到的損傷［22，23］。

農桿菌對柳枝稷幼苗SOD活性的影響是隨菌液濃度的增大表現出先升后降的趨勢，在1.2OD600時達到最大值（圖4）。方差分析結果表明，品系與濃度間的互作效應不顯著。品系間西稷3號極顯著高于西稷1號、2號（P＜0.01），而后兩者差異不顯著。在菌液濃度≤1.2OD600時，不同品系SOD活性極顯著上升（P＜0.01）；而當濃度達到1.6OD600時，SOD活性則極顯著降低（P＜0.01）。除西稷2號1.6OD600處理與對照間差異顯著外（P＜0.05），其余各處理間差異均達極顯著水平（P＜0.01）。這表明農桿菌對柳枝稷幼苗的傷害隨菌液濃度的增大而增大。在低濃度（≤1.2OD600）時，農桿菌對幼苗已經造成傷害，但植物本身可能還可以通過自身的保護作用進行修復，而當濃度繼續增大，其傷害已經超過幼苗的自身保護作用，植物受到嚴重傷害，最終影響幼苗的正常生長發育，甚至出現死苗現象。

2.5 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗CAT活性的影響

過氧化氫酶（CAT）普遍存在于植物組織中，是一種酶類清除劑，又稱為觸酶。它與超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD）等協同作用，可促使SOD酶產生的H2O2分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一［22，23］。

農桿菌對柳枝稷幼苗CAT活性的影響是隨菌液濃度的升高而呈上升趨勢（圖5），尤其是在濃度超過1.2 OD600時上升的速率更快。經方差分析，品系與濃度間互作效應不顯著；農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷不同品系幼苗CAT活性的影響存在差異，其中西稷1號和2號極顯著的高于西稷3號（P＜0.01），而前兩者差異不顯著。在菌液濃度≤0.8OD600時，柳枝稷不同品系幼苗CAT活性均極顯著上升（P＜0.01）；在0.8～1.2OD600間，西稷3號極顯著升高（P＜0.01），西稷1號上升趨勢不再顯著，而西稷2號則極顯著下降（P＜0.01）；此后幼苗CAT活性又均極顯著升高（P＜0.01）。這也證實農桿菌對柳枝稷幼苗的傷害是隨菌液濃度的升高而增大，尤其是在濃度超過1.2OD600時傷害更明顯。

2.6 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗POD活性的影響

過氧化物酶（POD）是植物體內普遍存在且活性較高的一種酶，主要存在于植物細胞的過氧化物酶體中，可催化過氧化氫、氧化酚類和胺類化合物，具有消除氧代謝中產生的過氧化氫和酚類、胺類等毒性物質的作用，是植物體內的保護酶之一［22］。

農桿菌對柳枝稷幼苗POD活性的影響與CAT活性的影響相似，隨菌液濃度的升高而升高，尤其是在濃度超過0.8OD600時上升的更快（圖6）。經方差分析，品系與菌液濃度的互作效應不顯著。而農桿菌對不同柳枝稷品系POD活性的影響存在差異，其中表現趨勢為西稷2號＞西稷3號＞西稷1號。農桿菌不同菌液濃度與對照間差異均達極顯著水平（P＜0.01）。再次說明農桿菌對柳枝稷具有傷害作用，且傷害程度隨菌液濃度的增大而增大。

圖3 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗葉綠素含量的影響Fig.3 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings chlorophyll content of P.virgatum

圖4 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗SOD活性的影響Fig.4 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings SOD activity of P.virgatum

圖5 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗CAT活性的影響Fig.5 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings CAT activity of P.virgatum

圖6 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗POD活性的影響Fig.6 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings POD activity of P.virgatum

2.7 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗MDA含量的影響

植物在逆境下遭受傷害與活性氧積累誘發的膜脂過氧化作用密切有關，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化作用最重要的產物之一，通過測定MDA可以間接測定膜系統受損傷的程度［23］。

農桿菌對柳枝稷幼苗MDA含量的影響是隨菌液濃度的升高而呈上升趨勢，尤其是在濃度超過0.8 OD600時，其上升速率變得更大（圖7）。經方差分析，品系與濃度間的互作效應不顯著。農桿菌對不同柳枝稷品系MDA含量的影響存在差異，其表現為西稷1、2號極顯著高于西稷3號（P＜0.01），而前兩者的差異不顯著。不同菌液濃度處理與對照間差異均達極顯著水平（P＜0.01），同一品種不同濃度處理間除西稷2號中1.2與1.6OD600處理差異不顯著外，其余均達極顯著水平（P＜0.01）。同樣反映了農桿菌對柳枝稷具有不利影響，且其影響隨農桿菌濃度的增加而增大。

圖7 農桿菌不同菌液濃度對柳枝稷幼苗MDA含量的影響Fig.7 Influence of different concentration of A.tumefaciens on seedlings MDA content of P.virgatum

3 結論與討論

在逆境條件下，植物通常會表現出衰老加速的趨勢，即葉綠素含量降低，葉色變黃，蛋白質、核酸等大分子水解加速，原生質膜以及內膜系統發生過氧化，細胞膜透性和膜脂過氧化產物MDA含量增加，SOD、CAT和POD酶促防御系統活性下降［23，24］。蔡建一等［25］認為SOD、CAT和POD三種酶在活性氧清除過程中具有較強的協調能力。在本試驗過程中發現，SOD活性是呈先升后降的趨勢，而CAT和POD則是呈上升趨勢，每種酶在不同程度的脅迫中所起的作用大小有所不同，在低濃度的農桿菌侵染脅迫下，SOD的活性較高起主要作用，而當濃度超過1.2OD600時，SOD活性降低，CAT和POD起主要作用。

不同基因型的植物對農桿菌的侵染敏感程度也不同［26］。本試驗對柳枝稷不同品系的種子發芽率、幼苗成苗率、葉綠素含量、SOD活性、CAT活性、POD活性以及MDA含量等指標測定結果表明，農桿菌對不同基因型柳枝稷的影響存在差異，西稷1號、西稷2號和西稷3號對農桿菌的敏感程度有所不同，西稷3號種子發芽率、幼苗成苗率、葉綠素含量和SOD活性都較西稷1號、西稷2號明顯偏高，而幼苗MDA含量明顯偏低，這表明西稷1、2號相比西稷3號對農桿菌的傷害更敏感，因此在進行農桿菌遺傳轉化時，可適當提高對西稷3號的侵染濃度。

在植物遺傳轉化體系的構建過程中，轉化效率和獲得轉基因植株的規模是評價轉化體系成功與否的兩大關鍵因素。陳明利等［27］認為農桿菌濃度OD600值小于0.5時，即使采用長時間侵染，轉化效率也不高。同時，農桿菌濃度也不宜過大，否則會造成農桿菌污染，傷害受體的正常生理活動和分化，最終難以提高轉化效率。在農桿菌遺傳轉化試驗中，不同作物對農桿菌菌液濃度的敏感程度也不同。奚亞軍等［20］在轉化小麥的試驗中農桿菌采用的1.5OD600，雷江麗等［28］在做中華結縷草（Zoysia sinica）轉化時農桿菌濃度卻采用0.9OD600，而關于柳枝稷農桿菌浸種濃度的文章還未見報道。本試驗通過設置不同濃度的農桿菌對柳枝稷種子萌發及幼苗生長發育的影響結果表明，農桿菌浸種對柳枝稷產生不利影響，且其不利影響隨農桿菌濃度的增大而增大，尤其是濃度超過1.2 OD600時，脅迫作用更為明顯。此時對柳枝稷種子及幼苗都產生了較為嚴重的傷害，柳枝稷種子發芽率顯著降低，幼苗出現生長緩慢、停止甚至出現死苗的現象。因此在充分考慮轉基因效率的同時，更要注意提高幼苗的成苗率，本試驗最終結果顯示在利用農桿菌浸種法進行柳枝稷遺傳轉化中農桿菌菌液濃度不應超過1.2OD600。

農桿菌侵染濃度、侵染時間和共培養條件是影響農桿菌轉化效率的最主要因素，本試驗主要針對農桿菌濃度進行研究，而未涉及侵染時間和共培養條件等其他的影響因素。因此在后面試驗中應對侵染時間和共培養條件以及它們之間的互作效應進行深入研究。

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