針刺治療重癥急性胰腺炎大鼠早期肺損傷組織中iNOS及eNOS mRNA表達影響的初步研究

蔣莉婭，黃繼人，趙弘卿，戴建良，張衛東，諸靜芬

(1.無錫市第二人民醫院中醫科，江蘇 無錫 214002;2.無錫市中西醫結合醫院肝膽胰中心，江蘇 無錫 214041;3.無錫市第二人民醫院呼吸科，江蘇 無錫 214002;4.無錫市中醫院普外科，江蘇 無錫 214001)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)易誘發全身炎癥反應綜合征(SIRS)及多器官功能不全綜合征(MODS)，病死率高。其死亡病例中有50%以上為早期合并急性肺損傷(acute injury of lungs，ALI)，可迅速惡化演變為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，從而成為SAP早期死亡的主要原因［1］。本實驗中，我們在中醫“肺與大腸相表里”理論指導下，針刺大鼠SAP早期ALI模型的肺、大腸及脾經相關穴位，并通過測定其肺損傷病理評分、肺組織濕/干重、肺組織誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表達水平，旨在進一步明確針刺對SAP大鼠ALI的保護作用及其機制［2］。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性 Wistar大鼠 40只，重量 250g±20g，購自南通大學實驗動物中心。結晶?；悄懰徕c、CORM-2購自Sigma公司。iNOS(GenBank中編號NM_012611.3)上游引物 P1:5'-ATC CCG AAA CGC TAC ACT-3'，下游引物 P2:5'-GTC TGG CGA AGA ACA ATC-3'，擴增片段大小為315 bp。eNOS(GenBank中編號NM_021838.2)上游引物 P1:5'-CTC ACC GAT ACA ACA TAC-3'，下游引物 P2:5'-GAG CCA TAC AGG ATA GTC-3'，擴增片段大小為469 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(GenBank中編號NM_017008.3)上游引物 P1:5'-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3'，下游引物 P2:5'-CTG TGC CGT TGA ACT TGC-3'，擴增片段大小為140 bp。以上引物均由上海英駿生物技術公司提供合成，Trizol和逆轉錄試劑盒購自上海英駿生物技術公司。

1.2 動物模型制備

40只大鼠隨機分為sham組、SAP組、針刺治療組及針刺對照組，每組10只。禁食、自由飲水12h后，1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。sham組模擬造模手術情況，開腹后僅輕度揉搓胰腺、翻轉腸管5min后即關腹;SAP組采用胰膽管逆行注入3.5%牛黃膽酸鈉(0.1ml/100g)的方法建立SAP模型［3］。針刺對照組在 SAP造模手術后0.5h，取穴肺、脾經穴位及其背腧穴，分別為尺澤、孔最、魚際、少商、地機、三陰交、肺俞及脾俞等，針刺0.5h后起針;針刺治療組于造模0.5h后，在對照組基礎上，加刺大腸經穴位及其背腧穴商陽、合谷、曲池和大腸俞，穴位定位參見《實驗針灸學》［4］。

1.3 標本采集及檢測

4組大鼠均于造?；蛐g后6h后處死，無菌操作下取出右肺下葉，液氮固定后置于－80℃冰箱保存，備行RT-PCR。取右肺中葉行常規病理學檢查并行病理學評分。計算左肺濕/干重比，間接反映肺水腫程度。取冷凍肺組織，用Trizol法抽提總RNA，再根據逆轉錄試劑盒產品說明書操作步驟合成第一鏈，合成的第一鏈分裝于 －20℃保存備用。采用 RTPCR法測定其 iNOS及 eNOS mRNA的表達情況。上海英駿生物技術公司合成iNOS、eNOS和GAPDH引物，用ddH2O溶解，分裝于 －20℃保存備用。在25μL PCR反應體系中加入 cDNA 1μL，擴增條件為:94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s;循環 30次。最后 72℃延伸 10 min，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。電泳鑒定后用凝膠圖像掃描儀測算各條帶的光密度值，分別以iNOS、eNOS條帶與GAPDH條帶光密度值比較表示其mRNA的表達水平。

1.4 統計學分析

應用SPSS13.0統計軟件采用方差分析處理數據，計量數據以均數±標準差(±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺臟病理學改變

(1)大體觀:sham組肺臟形態、結構基本正常。SAP組肺臟表面暗紅并伴有點片狀出血灶，水腫明顯。針刺治療組肺臟見少量出血點，水腫輕。針刺對照組肺臟表面有點片狀出血點，面積大小介于SAP組和針刺治療組之間，水腫程度亦介于前兩者之間;(2)光鏡檢查:sham組肺組織結構清晰，肺泡壁薄，無中性粒細胞浸潤。SAP組可見肺間質充血、水腫，炎性細胞浸潤;肺泡間隔明顯增厚，較多的肺泡萎縮，肺泡腔部分融合成肺大泡;毛細血管擴張、充血，局灶性肺泡內出血。針刺治療組肺組織炎癥明顯較SAP組減輕。針刺對照組光鏡結構、肺組織炎癥及肺間質充血、水腫程度均介于SAP組與治療組之間(圖1)。

圖1 各組肺組織病理學觀察(HE染色 ×100)

2.2 其他指標

表1圖2顯示，針刺治療組的肺濕/干重比和病理學評分較 SAP組、針刺對照組均顯著降低(P＜0.05);與SAP組和針刺對照組相比，針刺治療組肺組織中iNOS及eNOS mRNA表達也明顯下降(P＜0.05)。

表1 各組肺組織病理評分、肺組織濕/干重比、iNOS及eNOSmRNA表達的檢測結果比較(±s)

表1 各組肺組織病理評分、肺組織濕/干重比、iNOS及eNOSmRNA表達的檢測結果比較(±s)

注:與sham組比較:*P＜0.05;與 SAP組比較:#P＜0.05;與針刺對照組比較:△P＜0.05

組 別 肺濕/干重比 病理學評分iNOS mRNA eNOS mRNA Sham 組4.51 ±0.36 0 0.43 ±0.12 0.13 ±0.04針刺治療組 4.75 ±0.61#△ 5.64 ±0.460#△ 0.56 ±0.32#△ 0.24 ±0.05#△SAP 組 5.89 ±0.87* 7.95 ±1.540* 1.03 ±0.11* 0.72 ±0.06*針刺對照組 5.31 ±0.33* 6.05 ±1.024* 0.76 ±0.33* 0.45 ±0.05*

圖2 各組肺組織中iNOS和eNOS mRNA的表達水平

3 討論

SAP引起的全身炎癥反應能導致遠隔臟器功能障礙，其中 ALI是患者早期死亡的主要原因。ALI的主要病理變化是彌漫性肺泡和肺泡毛細血管膜損傷，大量炎性滲出積聚在肺間質和肺泡腔中形成充血、水腫［5］。研究發現，SAP器官衰竭發生率約為72% ～90.3%，其中肺臟衰竭最為常見，其次為心血管系統、肝臟和腎臟。因此，防治肺損傷成為降低SAP早期死亡率的重要措施。

NO是一種具有自由基性質的生物信息分子和效應分子，可參與體內多種生理和病理反應過程。生理狀態下機體一般產生低濃度和短暫的 NO，主要作為生物信使分子和細胞保護劑對機體起保護作用。而在病理狀態下，高濃度的NO可抑制三羧酸循環和DNA復制中關鍵酶的活性，造成能量代謝障礙和 DNA損傷，并增強核轉錄因子 κB(NF-κB)活性，進而增加 TNF-α等前炎癥細胞因子的產生，擴大炎癥反應，導致肺損傷。NOS是NO的一種合成酶，有nNOS(原生型)、iNOS及eNOS 3種類型。它在生理狀態下很少表達，但在炎癥、創傷等情況下表達增強，并使NO的分泌增加。SAP時NOS誘導機體產生的大量NO，對組織細胞具有損傷作用，參與機體多種疾病(如急性肺損傷、心血管失代償、消化道出血、急性腎功能衰竭、胰性腦病以及ARDS等)的發病過程。

有關“肺與大腸相表里”理論，早在《黃帝內經》中就有記載?！鹅`樞·經脈》:“肺手太陰之脈，起于中焦，下絡大腸……上膈屬肺。”“大腸手陽明之脈，絡肺下膈屬大腸”。該理論總結的宏觀規律指出，在空間和功能上不同的兩個臟腑，在生理和病理上具有密切聯系［6］。消化管、呼吸道及腺的上皮組織大多來源于原始消化管的內胚層，這種胚胎學上的共同來源被認為是“肺與大腸相表里”的生理結構基礎。

中醫學認為，胰腺炎發病多因飲食不節，損傷脾胃，釀濕生熱化毒，導致氣滯血瘀，濕熱壅結，水熱互結，陽明腑實。孫思邈《千金要方》中有以下記載:“脾重二斤三兩，扁廣三寸，長五寸，有散膏半斤……凡脾臟像土，與胃合為腑?！备鶕鲜鑫墨I記載，本實驗組更傾向于現代醫學中的“胰”接近于古代醫學中“脾”的觀點。

經驗表明，單一或聯合運用通里攻下、活血化瘀及清熱解毒湯劑口服、灌胃或保留灌腸等，均能在SAP早期有效地保護胰腺及減輕胰外器官的損傷。針灸的調節效應具有即時和多器官性。本實驗中，針刺治療組選擇針刺SAP大鼠肺經的尺澤、孔最、魚際和少商，能清熱解毒保肺，抑制肺組織中性粒細胞的大量浸潤;大腸經的商陽、合谷和曲池，能促進胃腸道的排空，通里攻下，減少腸道細菌易位;胰腺在十四經中無完全對應的經脈，可選擇脾經代替，地機為脾經“郄穴”，郄主急，故治療急性重癥胰腺炎有奇效。三陰交為足三陰經之會，“脾俞”為脾經背腧穴，脾統血，上述脾經三穴活血化瘀、引血下行。諸穴合用，共奏清胰保肺之功［2］。

本實驗中，SAP導致肺組織病理學評分、肺組織濕/干重比明顯升高，而針刺治療組則顯著降低了上述指標，說明針刺可以有效減輕SAP并發的ALI，針刺治療組上述指標低于對照組，進一步說明在“肺與大腸相表里”理論指導下的針刺治療組效果更為明顯。為探討其機制，我們通過檢測針刺對SAP大鼠肺組織中iNOS和eNOS mRNA的表達水平，探討內源性NOS在肺損傷中的作用。結果顯示，在SAP造模后6h后，針刺治療組肺組織iNOS、eNOS mRNA表達量均高于sham組，而低于SAP組和針刺對照組，這表明iNOS和eNOS mRNA的過量表達可能在SAP肺損傷中起重要作用，分析其原因可能是由于SAP時血循環來源的炎癥介質、細胞因子以及一些具有催化活性的酶等因素均能啟動細胞內基因轉錄，誘導 iNOS和 eNOS mRNA表達增加，催化產生大量的 NO，NO能強烈擴張肺毛細血管，增加血管通透性和蛋白溢出，造成肺組織低灌注、血流瘀滯、局部炎癥反應和通氣/血流比值失調，導致肺組織出現炎性細胞浸潤、間質水腫、充血等一系列病理生理過程。

研究表明，肺泡巨噬細胞活化可能是急性胰腺炎肺損傷的重要途徑。肺泡巨噬細胞活化后可產生許多活性介質，如NO、TNF-α、花生四烯酸等代謝產物，這些物質均為前炎癥介質，可引起炎性細胞聚集并浸潤入肺，引起肺損傷。本課題的以往研究［2］提示，針刺能顯著減輕SAP時肺組織損傷，其機制與抑制巨噬細胞功能、抑制肺泡巨噬細胞分泌 TNF-α和下調NO水平有關。結合本次實驗結果，從而得出結論:在“肺與大腸相表里”理論指導下的針刺治療，能顯著減輕SAP早期肺組織損傷，其機制可能與抑制肺泡巨噬細胞iNOS和eNOS mRNA過量表達，從而顯著下調NO水平有關。而明確其機制，從而深入闡釋“肺與大腸相表里”理論指導下針刺對SAP大鼠早期肺損傷的保護作用，仍有待于進一步的研究。

［1］Liu HB，Cui NQ，Li DH，et al.Role of Kupffer cells in acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis-associated lung injury of rats［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):403-407.

［2］蔣莉婭，黃繼人，趙弘卿，等.“肺與大腸相表里”理論在針刺治療重癥急性胰腺炎大鼠早期急性肺損傷中應用的實驗研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2011，17(11):1245-1247.

［3］張明鈞，姚瑋艷，喬敏敏，等.腸壁穿刺逆行胰膽管注射牛黃膽酸鈉重癥急性胰腺炎造模［J］.上海交通大學學報(醫學版)，2006，26(5):488-490.

［4］李忠仁.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2003:327-329.

［5］PavlidisTE， PavlidisET， SakantamisAK. Advancesin prognostic factors in acute pancreatitis:a mini-review［J］.HBPD INT，2010，9:482-486.

［6］李杰，程欣，賈鈺華.肺與大腸相表里物質基礎研究方法的探討［J］.中國中西醫結合雜志，2011，31(2):256-259.