穿心蓮內酯對糖尿病大鼠心肌氧化應激的影響

楊 蘋 林海涵 賀朝忠

(桂林醫學院，廣西 桂林 541004)

糖尿病心肌病(DCM)是心肌對糖尿病的急性反應而導致的慢性病理改變。這些急性反應包括基因表達異常、信號傳導改變及細胞凋亡。而高血糖是DCM的主要病因，高糖促進線粒體電子傳遞呼吸鏈生成的活性氧(ROS)，增加自由基生成機會，此外高糖還可損傷機體的抗氧化系統〔1〕。穿心蓮內酯(AP)為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.F.)Nees的有效成分之一。有資料證實AP對糖尿病小鼠的血糖有一定改善作用〔2〕。本研究通過觀察AP對糖尿病大鼠心肌的氧化應激的影響來探討其對心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 60只雄性清潔級SD大鼠(200±20)g，隨機分為陰性對照組(C組)8只、糖尿病造模組52只。AP在桂林醫藥站購買;高脂高糖飼料:由脂肪15%、蔗糖20%、雞蛋8%、膽固醇1%、食鹽0.5%、膽鹽2%和常規飼料53.5%混合;鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司);鹽酸二甲雙胍(北京京豐制藥有限公司產品，批號:090618);末端全血葡萄糖測試條(桂林優利特醫療電子有限公司，批號:20100208);戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號F20041117);考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及鈣(CA)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所(批號均為:20100527)。URIT-21血糖分析儀(桂林優利特醫療電子有限公司，批號:21010483);722分光光度儀(上海精密科學儀器有限公司，批號:703021094);ES-180J電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);J-200高速分散均質機(上海標本模型廠);Milli-Q超純水機(密理博中國有限公司，批號:F5MN91984)。

1.2 動物模型制備與分組 按參考文獻方法〔3〕稍加改進建立模型。大鼠適應性喂養1 w后，測血糖、尿蛋白各組間無差異。造模組給予高脂高糖飼料喂養，第4周造模組體重達到(260±30)g后，采用間隔1 w分別兩次性腹腔注射含1%STZ的檸檬酸緩沖液，實際每次STZ 30 mg/kg的方法誘導糖尿病大鼠模型。造模前禁食12 h，以0.1 mol/L，pH=4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解STZ配制成1%STZ溶液使用。對照組按體重注射相應量的緩沖液。注射4 h后，每只大鼠按10 ml/kg腹腔注射50%的葡萄糖溶液。7 d后行第2次造模。第2次注射后3 d斷尾取血測空腹血糖，空腹血糖＞16.8 mmol/L的大鼠，確定為糖尿病模型，共成模35只。按血糖分層隨機分組，分為糖尿病模型組(D組)11只、二甲雙胍組(M組)、AP小劑量組(LA組)、穿心蓮內酯大劑量組(HA組)各8只。用藥方案:第6周開始均為按10 ml/kg強制性灌胃，每日中午1次。C組、D組為蒸餾水;M組為2.5%二甲雙胍;LA組為0.5%AP;HA組為1%AP。所有大鼠在之后的實驗期間均喂標準飲食、自由覓水，不應用胰島素。

1.3 指標檢測 用電化學法血糖儀進行血糖檢測。第14周處死前1 w所有大鼠用金屬代謝籠留取24 h尿，測尿量及留取尿標本－20℃保存，1 w內測量。大鼠處死前先禁食12 h后，稱重、量體長、以40 mg/kg的1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后大鼠心臟采血，取全血測空腹血糖。迅速灌洗留取心臟后用電子天平稱重后取0.2 g左右的心肌組織，用生理鹽水和均質器制成10%的組織勻漿，－80℃保存1 w后測SOD、MDA、CA、CAT、組織勻漿蛋白含量。

1.4 統計學分析 實驗數據采用x±s表示，多組計量資料組間差異性比較數據處理，采用SPSS13.0統計軟件的One-Way ANOVA中的Duncan、LSD、Games-Howell法進行處理分析。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況、體重及血糖的變化 C組大鼠精神狀態良好，無死亡。糖尿病造模成功后的大鼠均出現多飲，多尿，多食，消瘦及生長行動遲緩等癥狀。其中在一段時間飼養后D組有3只死亡，M組有1只死亡。D組動物死亡考慮死因為血糖過高引起酮癥酸中毒或感染，M組考慮過度消瘦。至實驗結束時，M、HA組大鼠一般情況有所改善，且給藥組的血糖值都低于D組(P＜0.05)。第14周實驗終止時，C組體重指數(LEE指數)與D組、M組各組之間均有顯著差異(P＜0.05)，D組與HA組之間有顯著差異(P＜0.05)。D組給藥后空腹血糖與M，LA和HA組有顯著差異(P＜0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠心肌指數、血糖、體重指數的變化 與C組大鼠比，D組大鼠的心肌指數(HW/BW)增加，血糖、體重指數降低;HA組上述指標顯著區別于D組(P＜0.05);M組的心肌指數(HW/BW)、血糖低于D組(P＜0.05)。見表1。

表1 AP對STZ實驗性糖尿病大鼠血糖及心肌增生的影響(x±s)

2.3 大鼠心肌組織MDA、SOD、CAT、CA的變化 干預后，D組大鼠心肌組織的MDA水平高于正常組(P＜0.05)，而M和HA組心肌組織MDA水平顯著低于D組(P＜0.05)，表示高劑量AP作用與二甲雙胍相當。造模組大鼠心肌組織的SOD活性低于C組(P＜0.05)，而M和HA組的心肌組織SOD活性明顯高于D組(P＞0.05)。D組的CA離子濃度大于C組，且HA組明顯低于C組(P＞0.05)。見表2。

表2 AP對STZ實驗性糖尿病大鼠心肌MDA、CA，SOD、CAT活性的影響(x±s)

3 討論

DCM可導致心臟功能受損，心肌細胞死亡，心肌結構改變，最后發生心力衰竭。糖尿病可引起心肌細胞氧化損傷，從而導致細胞死亡。心肌細胞死亡是心臟對糖尿病的一個早期綜合性反應，所以心肌細胞的氧化損傷在DCM的發病中起關鍵性作用。有研究表明改善氧化應激水平和抗氧化系統，可以減輕糖尿病所引起的心肌損害〔4〕。機體內存在兩類自由基防御系統，一類是酶促防御系統包括:SOD、CAT等，另一類是非酶促防御系統:包括維生素C，谷胱甘肽等。正常情況下，自由基的產生和清除保持平衡，但在糖尿病情況下，體內自由基大大增加，氧化能力大大超過抗氧化能力而發生氧化應激，從而直接引起生物膜脂質過氧化、細胞內蛋白及酶變性 最后導致細胞死亡或凋亡，組織損傷和疾病發生。MDA是脂質過氧化的終產物;CA在一定程度上表明組織鈣超載的情況，反應凋亡的程度;SOD、CAT則是抗氧化酶的主要指標。本結果顯示AP對糖尿病大鼠心肌具有保護作用。本品對糖尿病大鼠所表現出的心肌保護效應，可能與其提高SOD抗氧化酶的活性有關，但發揮這些生物學效應的機制尚需進一步研究。

1 Moussa SA.Oxidtive stress in diabetes mellitus〔J〕.Romanian JBiophys，2008;18(3):225-36.

2 楊 蘋，韋 昊，秦慧勤，等.穿心蓮對正常小鼠和高血糖小鼠血糖影響的實驗研究〔J〕.時珍國醫國藥，2007;18(1):87-8.

3 田俊瑋，劉映紅，袁 芳，等.重組脂聯素對糖尿病腎病大鼠氧化應激的影響〔J〕.中國血液凈化，2009;20(3):158-62.

4 Zhang YW，Peng TQ，Zhu HQ，et al.Prevention of hyperglycemia-induced myocardial apoptosis by gene silencing of Toll-like receptor-4〔J〕.J Transl Med，2010;8:133.